蛋白激酶PLK1的分子動力學模擬和藥物設計、核受體PXR的分子對接研究.pdf

1、保羅樣激酶(Polo-1ike kinase，簡稱PLK)是一個與細胞周期的調控緊密相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，在有絲分裂(mitosis)的各個時期以及細胞周期檢測點響應中發(fā)揮重要的作用。在PLK的各家族成員中，PLK1的異常表達常常與腫瘤形成相關，并已經(jīng)在多種類型的癌癥中被檢測到。因此，研究PLK1的分子生物學和調節(jié)功能有助于揭示PLK1在細胞周期調節(jié)中扮演的角色以及它的激活與腫瘤形成之間的關系。論文的第一章綜述了PLK1的分子生

2、物學研究進展，包括PLK1在細胞周期中的作用、結構域以及相應的功能、與癌癥的關系、在藥物開發(fā)中的價值以及目前在抑制劑開發(fā)研究中的一些進展。由于它在有絲分裂調節(jié)中的特定角色，PLK1被認為是一個癌癥治療的潛在靶標。
　　 生物化學研究發(fā)現(xiàn)，在PLK1的激酶結構域和保羅盒結構域之間存在著一種分子內抑制作用，它對于PLK1的激酶活性調節(jié)有著重要的意義。同時，在激酶結構域上Thr210的磷酸化或者一段磷酸化小肽與PBD的結合都能解除這種

3、抑制作用?；谶@種現(xiàn)象，有人提出了一種PLK1的調節(jié)機理假說，認為磷酸化小肽與PBD的結合在KD-PBD的結合界面上誘導產生了某種未知的構象變化，從而導致PLK1的分子內相互作用被破壞。為了探討KD和PBD的動力學性質及其對分子內的活性調節(jié)的影響，我們利用各種計算方法包括同源模建、蛋白質蛋白質對接、分子動力學和構象主成分分析等，深入研究了PLK1的分子內調節(jié)機理。這部分內容在論文第二章進行了詳細的描述。動力學模擬結果顯示，KD和PBD都

4、分別擁有兩種狀態(tài)。在Thr210上的磷酸化使KD穩(wěn)定在關閉的狀態(tài)，而未磷酸化的KD在激活槽區(qū)是打開的，而只有未磷酸化的KD能與PBD結合。PBD則在兩種不同的構象之間互相變換，這兩種構象的主要區(qū)別在于PB1和PB2的相對取向不同，分別對應于PBD的打開和關閉狀態(tài)。同時，我們還觀察到磷酸化小肽與PBD的結合能夠中斷這種開合運動，使PBD的構象鎖定在關閉狀態(tài)。蛋白質-蛋白質對接結果揭示了打開狀態(tài)的KD和關閉狀態(tài)的PBD以一種相當有趣的方式互

5、相結合，其中KD的激活槽區(qū)緊扣PBD的L2連接，而PBD的磷酸化小肽結合口袋則被KD的一段螺旋α C所占據(jù)，形成一個所謂的“雙向咬合”的結合模式。這種結合模式較好地解釋了PBD對KD的激酶活性抑制現(xiàn)象，以及磷酸化小肽如何破壞這種分子內的相互作用。基于我們的模擬結果和分析，我們提出了一種原子水平上的KD-PBD之間的分子內調節(jié)機理。首先，KD的磷酸化狀態(tài)決定了它有兩種不同的構象，Thr210磷酸化時，KD的構象是關閉并且活性的；在Thr2

6、10未磷酸化時，KD的構象是打開并且非活性的。第二，PBD也有兩種不同的狀態(tài)，分別對應關閉狀態(tài)和打開狀態(tài)。磷酸化小肽的結合能夠將PBD穩(wěn)定在關閉的狀態(tài)。第三，打開狀態(tài)的KD與關閉狀態(tài)的PBD結合，從而抑制激酶的催化活性和PBD的磷酸化小肽結合能力。該研究在原子水平上為揭示PLK1的分子內調節(jié)機理提供了一些有意義的線索和結論。分子動力學模擬清晰地描述了KD和PBD在各種不同條件下的動態(tài)特征。大量的實驗現(xiàn)象驗證了我們的KD-PBD結合模型，

7、反過來肯定了我們模擬手段的正確性。該研究可能有助于指導新穎的PLK1抑制劑的發(fā)現(xiàn)與設計。
　　 近年來陸續(xù)有一些PLK1的激酶抑制劑被發(fā)現(xiàn)，這些抑制劑中的大多數(shù)對PLK1的激酶活性顯示出較強的抑制能力。但是，由于ATP結合口袋的高度保守性，這些抑制劑對PLK1的選擇性普遍較差。尋找作用于其它位點的抑制劑應該可以改善抑制劑的選擇性。在論文的第三章，我們以PBD的晶體結構為基礎，建立了兩個虛擬篩選模型，分別對SPECS和ACD兩個化

8、合物庫進行搜索，以發(fā)現(xiàn)新型的PLK1抑制劑。后處理程序包括一致性打分，類藥性評價，藥物化學家的建議等等，都被用來對候選化合物進行精簡。最后對SPECS和ACD庫分別購買了大約65和32個化合物。生物活性測試表明有超過七個候選化合物可以與PBD結合，其結合常數(shù)(Kd)均在μM級別。在這些候選化合物中，有一個化合物可以在細胞水平有效抑制小鼠白血病細胞P388的生長，其抑制的IC50值為3.33μ M。這個結果是十分令人振奮的，對于將宋的抗白

9、血病藥物開發(fā)可能具有指導意義。
　　 人類孕甾核受體是配體激活轉錄因子核受體家族成員之一，它是哺乳動物中細胞色素酶P450-3A基因表達的關鍵調節(jié)子。PXR能被大多數(shù)誘導CYP3A4基因表達的化合物所激活，并且它的激活與許多不利的藥物-藥物相互作用緊密相關。為了研究PXR配體結合位點上對于激活至關重要的結構特征，我們利用PXR的四個晶體結構，對30多個結構不同的PXR激動劑和拮抗劑進行了一系列分子對接研究。研究結果在論文的第四章