與肝細(xì)胞肝癌相關(guān)的兩個基因KIAA0101，DLK1的功能研究.pdf

1、根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2004年公布的資料顯示在過去10年間全球癌癥的發(fā)病率及死亡率增長了22％，其中肝癌無論從發(fā)病率還是死亡率來看，均為全球?qū)θ祟惿眢w健康危害最大的癌癥之一。尤其在東亞和非洲。在我國，肝癌是發(fā)病率僅次于胃癌的高發(fā)癌癥。肝癌和其它腫瘤一樣是遺傳和環(huán)境等諸多因素的相互作用所致，涉及大量相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控的改變。因此克隆，篩選和鑒定與肝癌相關(guān)的基因仍然是肝癌分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個前沿和重點研究課題。 尋找

2、肝癌相關(guān)基因的首要步驟之一是得到在肝癌組織中異常表達(dá)的基因。我們實驗室運用cDNA芯片的方法獲得了一批在肝癌中異常表達(dá)的已知和未知基因。對這些基因的進(jìn)一步功能研究將有助于對肝癌發(fā)病分子機理的深入了解。我們首先挑選了15個在芯片結(jié)果顯示有差異表達(dá)的基因，并擴大組織樣本，運用半定量RT-PCR方法做進(jìn)一步驗證。得到了2個較有意義的基因：KIAA0101和DLKl。本課題對這兩個基因與肝癌的相關(guān)性進(jìn)行較深入的研究。 KIAA0101，

3、cDNA全長888bp，編碼111個氨基酸，已經(jīng)有報導(dǎo)在甲狀腺癌，結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌中在mRNA水平上有異常表達(dá)，但在肝癌中尚無表達(dá)狀態(tài)的報導(dǎo)。先前的cDNA芯片結(jié)果提示KIAA0101在肝癌組織中表達(dá)較高，進(jìn)一步運用半定量RT-PCR方法顯示在8／15對樣本中，癌組織表達(dá)高于相應(yīng)的癌旁肝組織。利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了KIAA0101的蛋白并制備多克隆兔抗體，Westernblot結(jié)果顯示在25／30對組織標(biāo)本中肝癌組織中蛋白表達(dá)比相應(yīng)

4、的癌旁肝組織低，與mRNA的表達(dá)情況相反。組織芯片免疫組化結(jié)果顯示，在107／161例肝癌組織中，KIAA0101表達(dá)為弱陽性(+)或陰性(一)；而在相應(yīng)的癌旁肝組織中，僅有24／161例為弱陽性(+)或陰性(一)，統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異(P<0．05)。我們的結(jié)果顯示KIAA0101mRNA和蛋白表達(dá)水平在肝癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。生物信息學(xué)提示KIAAOl01蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)的線粒體，雙重免疫熒光的方法顯示KIAA0101可與線粒體內(nèi)

5、膜蛋白的熒光圖像大部分重疊，表明蛋白大部分定位于線粒體內(nèi)，同時少數(shù)位于核內(nèi)。利用線粒體特異性抗體從細(xì)胞總蛋白內(nèi)富集細(xì)胞內(nèi)線粒體蛋白，運用Westernblot方法也得到了相似的結(jié)果。將KIAA0101組建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，應(yīng)用pMACSmmII磁珠分選系統(tǒng)將KIAA0101瞬時高表達(dá)的細(xì)胞分離。體外生長曲線表明KIAAOi01對細(xì)胞的生長有抑制作用(P<0．05)；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示KIAAOi01高表達(dá)陽性細(xì)胞的S期比例為

6、21．35％±1．28，而相應(yīng)的對照細(xì)胞S期比例為29．45％+1．45，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P

7、)是一個跨膜蛋白，由383氨基酸組成，胞外有6個EGF結(jié)構(gòu)域，1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)區(qū)。它與notch-1的配體delta有較高的同源性，但因它不具有與notch-1相結(jié)合所必需的DZL結(jié)構(gòu)域，故推測它們互相之間不能結(jié)合。DLKl與脂肪細(xì)胞的形成密切相關(guān)，高表達(dá)時能夠抑制脂肪細(xì)胞的生成。DLKl是一個父系表達(dá)的印跡基因。已經(jīng)證明DLKl可以增加某些未分化神經(jīng)腫瘤的惡性程度，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、腦瘤和血液病中高表

8、達(dá)。另外它在血液和肝臟的祖細(xì)胞中高表達(dá)，已經(jīng)成為祖細(xì)胞的標(biāo)志之一。在小鼠的實驗中，RT-PCR方法證明DLKl在胚胎肝組織中高表達(dá)而在成體肝組織不表達(dá)。在鼠胚胎肝中利用DLKl的抗體可以分離出成肝細(xì)胞；體外培養(yǎng)實驗中，分離得到的DLK1+肝細(xì)胞增值活性高于DLKI'肝細(xì)胞。因此我們選擇DLKl作進(jìn)一步研究。半定量RT-PCR(5／M)，Northernblot(4／12)和Westernblot(6／17)結(jié)果中顯示DLKl在部分肝癌組

9、織中的mRNA和蛋白表達(dá)均高于相應(yīng)的癌旁肝組織。4例肝癌細(xì)胞株中，一株高表達(dá)(Hep3B)而另外三株(SMMC7721，7402和HepG2)沒有檢測到表達(dá)。在SMMC772l細(xì)胞株轉(zhuǎn)染篩選獲得了高表達(dá)DLKl的穩(wěn)定細(xì)胞株，同時運用腺病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建出含有DLKl的病毒。體外試驗中，穩(wěn)定表達(dá)DLKl的SMMC7721克隆株和利用腺病毒瞬時感染高表達(dá)的DLKl的SMMC772l細(xì)胞均比對照細(xì)胞生長較快(P<0．05)。裸鼠體內(nèi)成瘤試驗也表

10、明穩(wěn)定高表達(dá)DLKl對SMMC7721肝癌細(xì)胞的生長起促進(jìn)作用。利用nocodazol阻滯細(xì)胞于G2／M期后，在不同的間隔時間作細(xì)胞周期分析。結(jié)果顯示DLKl能夠使細(xì)胞較快地從G2／M期過渡到S期(實驗組為16小時，而對照組為21小時)。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，發(fā)現(xiàn)DLKl高表達(dá)的細(xì)胞中，細(xì)胞周期相關(guān)基因p34cdc2的蛋白表達(dá)雖然沒有變化，但15位酪氨酸的磷酸化狀態(tài)降低。已經(jīng)有報導(dǎo)p34cdc2蛋白的15位酪氨酸的低磷酸化可以導(dǎo)致蛋白活性的

11、增加從而加快細(xì)胞周期循環(huán)。我們進(jìn)行的p34cdc2蛋白體外激酶活性試驗中顯示，在DLKl高表達(dá)的細(xì)胞株中p34cdc2的激酶活性升高。在肝癌組織標(biāo)本中，雙重免疫熒光顯示DLKl高表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，AFP表達(dá)也較強，二者有明顯的相關(guān)性。提示DLKl高表達(dá)的肝癌細(xì)胞處于低分化狀態(tài)，而其增值能力比較強。綜上所述，DLKl在部分肝癌組織中處于高表達(dá)的狀態(tài)；在低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株SMMC7721轉(zhuǎn)染DLKl后，體內(nèi)外實驗結(jié)果表明可以促使腫瘤細(xì)胞生長