Anti-cMet抗體耦合空心納米金球?qū)m頸癌光熱治療增敏作用研究.pdf

1、背景：宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，在發(fā)展中國家，宮頸癌仍是腫瘤主要的死亡原因。放射治療在宮頸癌治療中占有重要地位，但其副作用及放療抵抗是臨床上需要解決的問題。光熱治療是在激光照射的基礎(chǔ)上，利用光熱轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的高熱量消除腫瘤細(xì)胞，以其全身副作用少和不易引起治療抵抗等特點正成為腫瘤治療新方法的研究熱點。cMet，也被稱作肝細(xì)胞生長因子受體(HGFR)，過表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞的表面，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及抗凋亡有關(guān)。本論文主要通過

2、合成具有特殊結(jié)構(gòu)的空心納米金球并偶聯(lián)抗cMet單克隆抗體以構(gòu)建生物相容性較好的靶向腫瘤細(xì)胞的生物探針，得到的靶向抗體金球在光熱治療所用的激光波長處具有明顯的紅外吸收峰，使得在較低能量的激光照射下即可達(dá)到靶向消融宮頸癌細(xì)胞的目的，從而提高光熱治療的治療效應(yīng)。
　　目的：討論靶向抗體金球在腫瘤光熱治療增敏方面的作用，并初步探討其對光熱治療增敏作用的生物學(xué)機制。
　　方法：利用金置換銀的方法合成大小、形狀均一的中空納米金球(HGN

3、s)，利用帶有異官能團(tuán)的聚乙二醇復(fù)合物(SH-PEG-COOH)作為連接劑，聚乙二醇復(fù)合物的巰基末端與空心納米金球表面的金原子形成穩(wěn)定的Au-S連接，聚乙二醇復(fù)合物的羧基末端與抗cMet單克隆抗體的氨基末端形成酰胺鍵，從而合成穩(wěn)定的、分散性良好的具有靶向功能的抗體納米金球(anti-cMet/HGNs)。利用高分辨率透射電子顯微鏡(TEM)和紫外-可見-近紅外光譜等對納米金球進(jìn)行表征。選擇人子宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa和人子宮頸鱗癌細(xì)胞系C

4、aSki兩種細(xì)胞系作為體外實驗對象來研究光熱作用對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。應(yīng)用免疫熒光對兩種細(xì)胞系進(jìn)行染色并使用共聚焦熒光顯微鏡觀察兩種宮頸癌細(xì)胞表面肝細(xì)胞因子受體-cMet的表達(dá)情況。應(yīng)用CCK-8方法通過檢測不同濃度HGNs和anti-cMet/HGNs對細(xì)胞抑制率的影響，研究它們對兩種細(xì)胞的毒性作用。CCK-8實驗篩選出細(xì)胞相容性良好的納米金工作濃度即為安全的生物濃度，在此藥物濃度下進(jìn)行接下來的實驗。利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法

5、(ICP-AES)統(tǒng)計兩種細(xì)胞系對HGNs和anti-cMet/HGNs的攝取情況。兩種細(xì)胞系分別分為四組:對照組，NIR照射組，HGNs+NIR照射組以及anti-cMet/HGNs+NIR照射組。宮頸癌細(xì)胞攝取納米金球后，應(yīng)用與抗體金球等離子共振吸收峰相近的NIR(808nm)激光照射，照射能量采用1.7J/cm2，近紅外光光斑面積為1 cm×2cm，照射時間為10分鐘。使用CCK-8法應(yīng)用酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞在450nm處的吸光度值

6、以評價納米金球?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)化為熱能后殺傷腫瘤細(xì)胞的效能。將各組細(xì)胞用FITC AnnexinⅤ和PI雙染后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。利用Western Blot測定各組細(xì)胞對凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：所制備的平均粒徑67.35nm平均壁厚7.25nm的空心納米金球規(guī)格均一，等離子共振吸收峰在788nm左右。經(jīng)聚乙二醇復(fù)合物修飾的空心納米金球結(jié)合抗cMet單克隆抗體后得到靶向抗體金球(anti-cMet/HGNs)，其等離

7、子共振吸收峰發(fā)生了約20nm的輕度右移。HeLa和CaSki兩種細(xì)胞系均可在細(xì)胞膜觀察到cMet的高表達(dá)。經(jīng)聚乙二醇復(fù)合物修飾后的抗體金球與空心納米金球相比，其細(xì)胞毒性明顯降低?？招募{米金球?qū)eLa的半數(shù)抑制濃度(IC50)為1.1 nmol/L，對CaSki的IC50為0.6nmol/L。ICP-AES結(jié)果顯示兩種細(xì)胞系對靶向抗體金球的攝取量均明顯高于對空心納米金球的攝取量。納米金球分別與兩種細(xì)胞共孵育24小時，接受NIR激光照射后

8、，CCK-8法測得抗體金球+NIR照射組的細(xì)胞抑制率分別為34.8％(HeLa)和53.6％(CaSki)，其余三組未見明顯的細(xì)胞死亡，差異具有顯著性(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀測得接受激光照射的抗體金球組的細(xì)胞凋亡率分別為8.54％(HeLa)和31.6％(CaSki)。接受激光照射后，攝取納米金球組中Bax，Caspase-3和Cyclin E2在兩種細(xì)胞系的表達(dá)量均高于對照組，而Bcl-2的表達(dá)量則與之相反。其中，抗體金球組比裸金