我國部分地區(qū)雞源空腸彎曲菌流行病學(xué)及運送flaA基因的殼聚糖納米DNA疫苗免疫生物學(xué)特性研究.pdf

1、彎曲菌(Campylobacter)是全球范圍內(nèi)主要的人獸共患性、細菌性腸道病原菌之一，對人致病的彎曲菌中99％的是空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni，C．jejuni)，其次是結(jié)腸彎曲菌(Campylobacter coli，C. coli)，其它彎曲菌偶爾致病。特定血清型空腸彎曲菌引起的腸炎是人格林一巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)的重要前驅(qū)因子。近年來，許多國家人彎曲菌病的發(fā)生

2、率呈指數(shù)增長趨勢。彎曲菌是野生、家養(yǎng)動物的正常寄居菌，在腸道內(nèi)有大量細菌，感染的動物通常無明顯病癥，但可長期向外界排菌，通過排泄物或分娩污染食物和飲水，從而引起人類感染。其中，家禽是彎曲菌病最重要的傳染源，控制或清除禽類彎曲菌是預(yù)防和控制人空腸彎曲菌的重要前提。 本研究的主要內(nèi)容與目的是：(1)較為系統(tǒng)地調(diào)查與分析我國部分地區(qū)雞群中彎曲菌流行特點，并應(yīng)用國標方法鑒定分離株的生化特性，以2005年美國臨床實驗室標準化研究所(CLS

3、I)推薦使用的瓊脂擴散法進行耐藥分析：(2)雞源空腸彎曲菌地方分離株毒力相關(guān)基因分析及對HT-29細胞感染分析；(3)基于RAPD和PFGE技術(shù)的不同源空腸彎曲菌分離株分子亞分型研究，探究雞空腸彎曲菌在人彎曲菌病中的作用；(4)雞空腸彎曲菌新型DNA疫苗構(gòu)建及其免疫生物學(xué)特性。 1我國部分地區(qū)雞群中彎曲菌流行現(xiàn)狀和耐藥特性調(diào)查與分析2005年7月至2007年12月，選取我國部分省市，采集不同品種、不同類型的雞群樣品進行空腸彎曲菌

4、和結(jié)腸彎曲菌流行病學(xué)調(diào)查，40個雞群中空腸彎曲菌陽性的有34個，陽性率為85％、結(jié)腸彎曲菌陽性率40％。在4891份雞肛門棉拭樣品中，共檢測出773份空腸彎曲菌陽性、平均陽性率15.80％，55份結(jié)腸彎曲菌陽性、平均陽性率1.12％；其中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌混合污染的樣品為19份，平均陽性率0.39％以上：雞飼養(yǎng)環(huán)境樣品217份，6份空腸彎曲菌陽性，陽性率2.76％。不同雞群感染率懸殊較大，空腸彎曲菌陽性率從0到73.3％、結(jié)腸彎曲菌

5、從0到7.4％。流行病學(xué)統(tǒng)計分析表明，規(guī)?；曫B(yǎng)雞群的感染率顯著高于散養(yǎng)雞群(p<0.01)，品系雞群顯著高于非品系(p<0.01)，不同品系雞群的感染率存在較大差異，我國地方品種雞的雞群感染率較低，祖代雞群的感染率顯著高于商品代和父母代(p<0.01)。 240株雞源空腸彎曲菌、34株結(jié)腸彎曲菌的生化特性和耐藥性研究顯示，空腸彎曲菌對8大類21種抗生素高度敏感的是：阿莫西林(AMC)96.67％、慶大霉素(CN)90.00％、阿齊紅霉

6、素(AZM)91.25％、鏈霉素(S)87.92％、紅霉素(E)85.42％，高度耐藥的是：頭孢拉定(CE)98.33％、頭孢哌酮(CFP)100.00％、頭孢克羅(CEC)92.50％、諾氟沙星(NOR)92.08％、恩諾沙星(ENR)95.68％、環(huán)丙沙星(CIP)92.08％、左懸氧氟沙星(LEV)91.25％、復(fù)方新諾明(SXT)99.58％、四環(huán)素(TE)89.58％、強力霉素(DO)88.33％；耐藥譜主要集中在8耐至14耐

7、，達90.00％。34株結(jié)腸彎曲菌只對阿莫西林(AMC)高度敏感，91.18％。結(jié)腸彎曲菌耐藥性和多重耐藥性較空腸彎曲菌更為嚴重。不同地區(qū)、不同種類雞群分離株耐藥性和多重耐藥性存在差異。 我國雞群的空腸彎曲菌對臨床上常用的喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類和大多數(shù)頭孢菌素類抗生素均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性；而且結(jié)腸彎曲菌的耐藥性更為嚴重，值得關(guān)注，必須加強各地彎曲菌耐藥性和抗生素使用情況的監(jiān)測，及時調(diào)整用藥方案和公共衛(wèi)生策略。 2

8、雞源空腸彎曲菌地方分離株毒力相關(guān)基因分析及對HT-29細胞感染分析282株雞源空腸彎曲菌地方分離株毒力相關(guān)基因分析顯示，黏附相關(guān)基因cadF、peblA、racR的平均攜帶率分別為90.07％、95.04％和97.87％，趨化性調(diào)節(jié)基因cheY,docA的平均攜帶率分別為95.39％和(92.20％，侵襲蛋白基因iamA的平均攜帶率為87.94％，鞭毛蛋白基因flaA的平均攜帶率為86.17％，毒素調(diào)節(jié)基因cdt、wlaN和virBll

9、質(zhì)?；虻钠骄鶖y帶率分別為71.28％、48.94％和7.08％；86.75％的細菌含有6個以上的毒力相關(guān)基因。結(jié)果顯示，不同來源雞分離株的毒力相關(guān)基因攜帶無顯著性差異。 分離株對HT-29細胞的侵襲力試驗表明，119株分離株中，65株細菌無侵襲能力，占總數(shù)的54.62％；44株細菌的侵襲能力比較低，在0.0001％-0.1％之間，菌株所占比例為36.97％;10株細菌的侵襲能力較高，在0.1％-2％之間，比例為8.40％。不同

10、侵襲能力分離株毒力相關(guān)基因分析顯示：隨著侵襲力的不同，分離株的基因攜帶有一定變化，flaA、cadF、docA、racR、iamA、peblA和cheY的攜帶率隨侵襲力上升而下降，而wlaN和cdt隨侵襲力上升而上升。侵襲力與相關(guān)基因有密切關(guān)系，但非一一對應(yīng)關(guān)系，而是相互作用，互為交叉的關(guān)系。 不同譜系分離株對HT-29的黏附率和侵襲率表明，譜系Ⅳ分離株高于譜系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分離株，相關(guān)毒力基因分析顯示，在空腸彎曲菌侵襲HT-29上

11、皮細胞過程中，黏附相關(guān)基因cadF、peblA、racR，趨化性調(diào)節(jié)基因cheY、docA和侵襲蛋白基因iamA起重要作用。 3不同源空腸彎曲菌分離株RAPD和PFGE分子亞分型研究337株不同來源的空腸彎曲菌PCR-RAPD分析表明，共得到27個基因型別，主要型別有5、6、7、9、12、14、15、22，占83.09％，其中菌株分布最集中的是型別5、9、14和15，所占比例分別為14.84％、17.51％、11.28％和12.

12、76％，而在型別1-4、8、10、13、17、20、21和24-27中出現(xiàn)的菌株較少，比例均低于1％。此外，在不同來源分離的菌株中均含有5、7、9、14和15基因型別，占63.51％。276株不同源分離株P(guān)FGE圖譜可分為4個遺傳譜系、46個克隆組群，且我國空腸彎曲菌分離株主要屬于PFGE遺傳譜系Ⅲ和Ⅳ。不同源分離株在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ遺傳譜系中，不同源分離株在各克隆組群中呈交叉分布，雞源分離株均占有優(yōu)勢，分別為50％、65％、70.59％

13、、64.10％，而腹瀉病人、牛群和市場食品分離株遺傳譜型分布于各型中，表明雞是空腸彎曲菌感染的主要來源。 分子亞分型研究分析表明，PCR-RAPD和PFGE可作為研究空腸彎曲菌來源和傳播途徑的有力工具，且PFGE的分辨力強于PCR-RAPD。我國空腸彎曲菌分離株存在優(yōu)勢的遺傳譜系，不同源分離株呈高度交叉分布，人彎曲菌的感染與市場食品、動物源彎曲菌感染密切相關(guān)，可能存在著相同的傳染源，而且雞源彎曲菌是人類彎曲菌病的主要傳染源之一。

14、 4運送空腸彎曲菌flaA基因的殼聚糖納米DNA疫苗免疫生物學(xué)特性根據(jù)GenBank登陸序列(gi：30407139)，利用DNAStar軟件分析，按正確的閱讀順序設(shè)計合成引物，PCR擴增空腸彎曲菌鞭毛蛋白基因flaA，將PCR產(chǎn)物回收、序列測定后，與pGEM(R) T easy vector連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-flaA，用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切回收后插入經(jīng)同樣雙酶切的pCAGGS載體，構(gòu)建成pCAGGS-flaA。將

15、重組質(zhì)粒pCAGGS-flaA轉(zhuǎn)染COS-7細胞，間接免疫熒光檢測表明重組質(zhì)粒pCAGGS-flaA在轉(zhuǎn)染的COS-7細胞中能檢測到表達蛋白。應(yīng)用現(xiàn)代納米技術(shù)研制殼聚糖一重組質(zhì)粒，1％瓊脂糖電泳檢測表明殼聚糖已經(jīng)包裹了質(zhì)粒，包裹率達91.9％，透射電子顯微鏡觀察到殼聚糖己將質(zhì)粒包裹形成直徑100 nm左右的圓球形顆粒。 白萊航雞動物試驗顯示，二免后14天均能檢測到特異性抗體，但抗體滴度較低；三免后14天抗體水平上升明顯，能誘導(dǎo)雞

16、產(chǎn)生針對空腸彎曲菌鞭毛蛋白的體液、黏膜免疫應(yīng)答，且與對照組具有顯著性差異(p<0.01)：流式細胞儀測定雞脾臟和盲腸扁桃體CD4+/CD8+細胞的數(shù)量變化表明，CS-pCAGGS-flaA三免后導(dǎo)致脾臟和盲腸扁桃體CD4+／CD8+細胞數(shù)量比值的升高，CD4+細胞的數(shù)量高于CD8+細胞。RT-PCR測定雞脾臟細胞IL-4、IFN-γ可知，二免、三免后14天脾臟細胞IL-4的量強于對照組，且IL-4的量強于IFN-γ?？诜ザ竞?，疫苗組在