星形膠質(zhì)細(xì)胞Cdk5的表達(dá)及功能研究.pdf

1、第一部分大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)與鑒定Cdk5在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的：研究Cdk5在體外原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　方法：取出生3天內(nèi)SD大鼠皮層，減碎組織，0.125％胰酶消化，200M濾網(wǎng)過濾，800rpm4°8min離心，重懸細(xì)胞，置于37°細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。采用GFAP免疫熒光鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度，并通過免疫熒光染色觀察Cdk5在大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：通過參考文獻(xiàn)培

2、養(yǎng)、純化、鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞，采用GFAP免疫熒光鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)到95%以上。免疫熒光染色顯示Cdk5在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。
　　結(jié)論： Cdk5在皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)豐富。
　　第二部分星形膠質(zhì)細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染Cdk5-siRNA后對(duì)細(xì)胞增殖、攝取Glu能力及分泌BDNF的影響
　　目的：通過星形膠質(zhì)細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染Cdk5-siRNA,觀察轉(zhuǎn)染后星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期、增殖、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、谷氨酸攝取能力的變化情況。<

3、br>　　方法：原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，傳代，純度鑒定>95%后給予體外轉(zhuǎn)染Cdk5-siRNA,利用懸浮轉(zhuǎn)染方法，以提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后，通過RT-PCR，Western blot篩選出最有效的Cdk5-siRNA序列，以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)分為CN-siRNA,CN-siT3,OGD-siRNA,OGD-siT3實(shí)驗(yàn)組，研究siRNA的轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖、攝取Glu能力及分泌BDNF的影響
　　結(jié)果：通過星形膠質(zhì)細(xì)

4、胞體外懸浮轉(zhuǎn)染Cdk5-siRNA后，篩選出第三個(gè)序列為沉默效率最高的序列；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示體外轉(zhuǎn)染Cdk5-siRNA后，不論是正常條件還是糖氧剝奪的環(huán)境，星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期S期的比例增加；同時(shí)Edu結(jié)果表明，體外轉(zhuǎn)染Cdk5-siRNA后，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖；星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體Western blot結(jié)果顯示體外轉(zhuǎn)染Cdk5-siRNA后，轉(zhuǎn)染Cdk5-siT3組下調(diào)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力結(jié)