CCK-8對(duì)CIA小鼠脾細(xì)胞增殖及Th1-Th2細(xì)胞因子平衡的影響.pdf

1、目的：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明的慢性炎癥性自身免疫性疾病。其病理變化為中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤關(guān)節(jié)，導(dǎo)致滑膜的增生和新生血管的生成；這些細(xì)胞可釋放出過量的趨化因子使更多的細(xì)胞聚集于炎性部位，并釋放基質(zhì)蛋白酶和細(xì)胞因子導(dǎo)致關(guān)節(jié)的破壞。目前臨床和實(shí)驗(yàn)均表明：在RA的誘導(dǎo)和急性期以Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生為主，而在疾病的緩解期與Th2介導(dǎo)的反應(yīng)相關(guān)，提示抗原誘導(dǎo)的Th1/

2、Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答失衡及炎癥反應(yīng)是其主要發(fā)病機(jī)制。 CIA(collagen-induced arthritis)為膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎，是用Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen，C Ⅱ)免疫對(duì)其敏感的鼠類，誘導(dǎo)多關(guān)節(jié)發(fā)生炎癥，其與人類的RA在臨床表現(xiàn)、組織學(xué)和免疫學(xué)特征方面很相近.CIA動(dòng)物模型被認(rèn)為是研究人類RA發(fā)病機(jī)制和探索治療新方法的良好動(dòng)物模型。 膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是廣泛分布于

3、體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)的神經(jīng)肽，作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)發(fā)揮重要作用，具有多種生物學(xué)功能℃CK-8是具有CCK全部活性的最小單位。CCK通過與細(xì)胞膜上的CCK受體結(jié)合介導(dǎo)其生理調(diào)節(jié)功能。研究已證實(shí)在巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞均表達(dá)CCK受體，說明CCK對(duì)免疫系統(tǒng)多靶位的廣泛作用。最近研究表明CCK-8具有一定的抗內(nèi)毒素休克和緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，CCK-8對(duì)鈅孔戚血藍(lán)蛋白誘導(dǎo)的小鼠Th1/Th2細(xì)胞反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，可抑制Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的

4、表達(dá)，增加Th2型細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)。但CCK-8是否對(duì)CIA小鼠具有調(diào)節(jié)作用，其免疫學(xué)機(jī)制如何尚未見報(bào)道?因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察CCK-8對(duì)CIA小鼠脾細(xì)胞增殖和Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的影響，探討CCK-8在RA發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，為治療RA尋找新的靶點(diǎn)。方法：1健康的DBA/1小鼠18只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(6只)和CIA組(12只)，造模第30天取正常對(duì)照組和CIA組小鼠的脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105cell/孔，接種于

5、96孔板中。將其分為9組給藥，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔：(1)正常對(duì)照組(NS組)：正常小鼠脾細(xì)胞中加入PBS；(2)CIA對(duì)照組：CIA小鼠脾細(xì)胞中加入PBS；(3)CII(100μg/ml)組：CIA小鼠脾細(xì)胞加入CII(終濃度為100μg/ml)；(4)CCK-8(10-8mol/L)組：CIA小鼠脾細(xì)胞加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)。(5)CII+CCK-8(10-6mol/L)組：CIA小鼠脾細(xì)胞先加入CCK-8(終濃度

6、為10-6mol/L)再加入CII(終濃度為100μg/ml)；(6)CII+CCK-8(10-8mol/L)組：CIA小鼠脾細(xì)胞先加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)再加入CII(終濃度為100μg/ml)；(7)CII+CCK-8(10-10mol/L)組：CIA小鼠脾細(xì)胞先加入CCK-8(終濃度為10-10mol/L)再加入CII(終濃度為100μg/ml)；(8)CII+CCK-8(10-8mol/L)+CR1409(1

7、0-6mol/L)組：CIA小鼠脾細(xì)胞先加入CR1409(終濃度為10-6mol/L)再加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)最后加入CII(終濃度為100μg/ml)；(9)CII+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)組：CIA小鼠脾細(xì)胞先加入CR2945(終濃度為10-6mol/L)再加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)最后加入C Ⅱ(終濃度為100μg/ml)。孵育54小時(shí)后加入3H-

8、TdR繼續(xù)孵育18小時(shí)用[3H]-TdR摻入法測脾細(xì)胞增殖，觀察CCK-8對(duì)CIA小鼠脾細(xì)胞增殖的影響。 2 取CIA小鼠脾細(xì)胞將其分為8組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔：(1)對(duì)照組：脾細(xì)胞中加入PBS；(2)C II(100μg/ml)組：脾細(xì)胞中加入C II(100μg/ml)；(3)CCK-8(10-8mol/L)組：在脾細(xì)胞中加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)；(4)C Ⅱ+CCK-8(10-6mol/L)組：在脾細(xì)胞中先加入C

9、CK-8(終濃度為10-6mol/L)再加入C Ⅱ(終濃度為100μg/ml)；(5)C Ⅱ+CCK-(10-8mo1/L)組：在脾細(xì)胞中先加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)再加入 C Ⅱ(終濃度為100μg/ml)；(6)C Ⅱ+CCK-8(10-10mol/L)組：在脾細(xì)胞中先加入CCK-8(終濃度為10-10mol/L)，再加入C II(終濃度為1 00μg/m1)； (7)C Ⅱ+CCK-8(1O-8mol/L)+CR

10、 1 409(10-6mol/L)組：在脾細(xì)胞中先加入CRl409(終濃度為10-6mol/L)再加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)最后加入C Ⅱ(終濃度為100μg/ml)；(8)C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)組：在脾細(xì)胞中先加入CR2945(終濃度為10-6mol/L)再加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)最后加入C Ⅱ(終濃度為100pg/ml)。孵育48h后用ELI

11、SA法檢測上述脾細(xì)胞上清液中IL-4和IFN-γ的含量觀察CCK-8對(duì)CIA小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的影響。 結(jié)果： 1.CCK-8對(duì)CIA小鼠脾細(xì)胞增殖的影響：CIA對(duì)照組脾細(xì)胞cpm值(10137.02±885.98)較正常對(duì)照組(6476.60±595.82)增高(p＜0.05)，C Ⅱ(100μg/ml)組(21732.36±3449.73)較CIA對(duì)照組增高(P＜0.01)，單獨(dú)CCK-8對(duì)脾細(xì)胞增殖無明

12、顯作用。CⅡ+CCK-8(10-6mol/L)組、CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)組、CⅡ+CCK-8(10-10 mol/L)組cpm值(9816.75±413.14、10937.11±1332.87、12996.21 ±1 890.65)均較C Ⅱ(100μg/ml)組降低(P＜0.01)，C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR1409(10-6mol/L)組、C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(1

13、0-6mol/L)組cpm值(16252.12±2210.41、 15145.39±3084.48)較C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)組增高(P＜0.05)。 2 CCK-8對(duì)CIA小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的影響2.1 CCK-8對(duì)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的影響：CIA小鼠脾細(xì)胞上清液中IFN-γ的濃度：C Ⅱ組(107.96±0.81ng/L)較對(duì)照組(60.60±0.98ng/L)升高(P＜0.01)，CCK-8組(

14、58.44 ±8.57ng/L)與對(duì)照組相比無明顯作用，C Ⅱ+CCK-8(10-6mol/L)組、C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)組IFN-γ的濃度(86.40±7.1 3ng/L、94.04±3.24ng/L)均較C Ⅱ組降低(P＜0.01)，C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR 1409(10-6mol/L、)組及C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)組IFN-γ的濃度(10

15、1.99±3.20ng/L、102.80±4.43ng/L)較C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)組均升高(P＜0.05)。 2.2 CCK-8對(duì)Th2型細(xì)胞因子IL-4的影響：CIA小鼠脾細(xì)胞上清液中IL-4的濃度：C Ⅱ組(22.41±2.37ng/L)較對(duì)照組(25.56 ±2.08ng/L)降低(P＜0.01)，CCK-8組(26.73±1.53ng/L)較對(duì)照組無明顯作用，C Ⅱ+CCK-8(10-6mol/L)組

16、、C Ⅱ+CCK-8(10-6mol/L)組IL-4濃度(36.03±2.37ng/L、27.23±3.79ng/L)均較C Ⅱ組升高(P＜0.05)，C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR1409(10-6mol/L)組及C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)組IL-4的濃度(23.25±1.82ng/L、23.50±1.27ng/L)較C II+CCK-8(1 0-8mol/L)組均降低