同種異體胰島及胰腺干細胞來源的胰島樣結構序貫移植治療糖尿病.pdf

1、目的：
　　通過分離、純化大鼠的胰島及胰腺導管上皮細胞，并在體外一定條件下培養(yǎng)，使胰腺導管上皮細胞擴增、轉分化為具有胰島素分泌功能的胰島細胞，將胰島及誘導分化2周的胰腺導管上皮細胞來源的胰島樣結構序貫移植到藥物誘導的糖尿病大鼠體內(nèi)，觀察糖尿病大鼠的血糖及生存情況來探討胰島及胰腺導管上皮細胞來源的胰島樣結構序貫移植治療糖尿病的可能性并為將此方法用于臨床提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　將大鼠胰腺組織以膠原酶V消化，然后用非

2、連續(xù)性密度梯度離心法將胰腺外分泌細胞、導管上皮細胞和胰島分離純化，導管上皮細胞即具有轉分化潛能的胰腺干細胞，在體外經(jīng)CMRL1066及不含血清的DMEM／F12加多種營養(yǎng)因子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)27d。于培養(yǎng)的不同時間點（1，3，5，7，14，21，27d）取細胞作PDX-1、CK-19等單抗的免疫組化染色,光鏡和電鏡觀察不同時間點的細胞形態(tài)學變化。按照60mg／kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，選取連續(xù)2次血糖濃度高于16．7mmol／L的

3、大鼠作為糖尿病模型。采用完全隨機法將已成模的糖尿病大鼠分為3組：A組：胰島移植組13只，腎被膜下植入新鮮大鼠胰島（200±50個）；B組：胰島及胰腺干細胞來源的胰島樣結構序貫移植組13只，腎被膜下植入新鮮大鼠胰島（200±50個）及胰腺干細胞來源的胰島樣結構約2×106個；C組：糖尿病對照組10只，腎被膜下植入培養(yǎng)液。3組大鼠均于移植前及移植后48h測空腹血糖濃度，之后每天經(jīng)尾靜脈采血測空腹血糖觀察生存情況。
　　結果：
　

4、　通過分離純化平均每只大鼠可獲得100±50個胰島及大量胰腺導管上皮細胞。體外培養(yǎng)時光鏡下胰腺干細胞在培養(yǎng)后第1d即貼壁生長。培養(yǎng)5d內(nèi)，貼壁細胞迅速擴增為鵝卵石樣小細胞片、大細胞片進而分裂增殖成單層細胞。細胞培養(yǎng)第7d，鵝卵石樣細胞片迅速擴大，胰島樣芽團開始從細胞片或單層細胞的中央或邊緣出現(xiàn)。培養(yǎng)第21到27d，大量較成熟的胰島樣結構出現(xiàn)，雙硫腙染色呈強陽性。細胞培養(yǎng)第7d，幾乎所有細胞表面均可見短粗的微絨毛及細胞間較致密的連接復合體

5、。第15d，部分細胞的短粗微絨毛消失，細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等且密度不均的顆粒，其周圍可見較多的中間絲。第27d，部分細胞內(nèi)出現(xiàn)密度較高的顆粒，另有部分細胞內(nèi)有較多具有低密度暈環(huán)的顆粒，大量含顆粒的細胞連接成片，中間絲基本消失。免疫組織化學染色顯示：細胞培養(yǎng)第1d，6孔玻板中的部分細胞呈CK-l9抗體染色強陽性。大部分細胞呈PDX-l抗體染色陽性，部分呈強陽性，部分呈弱陽性，少數(shù)細胞為陰性。第7d起，可見胰島樣細胞芽團出現(xiàn)并逐漸增多，絕大多數(shù)

6、細胞集落和胰島樣細胞芽團均為CK-19強陽性。14d至27d，胰島樣細胞芽團不斷增大，PDX-l抗體染色呈強陽性。移植前3組大鼠的血糖均在16.7mmol／L以上，胰島移植組和胰島+胰腺干細胞來源的胰島樣結構序貫移植組在移植后1周內(nèi)測血糖濃度均有所降低，序貫移植組降低的幅度較胰島組大，但仍高于10mmol／L。第2周后兩組的血糖濃度均降低到10mmol／L以下，序貫移植組大鼠的血糖均低于胰島移植組。第3周后胰島移植組的血糖開始上升逐漸升

7、高到移植前的血糖水平，而序貫移植組的血糖則維持到5mmol／L水平。糖尿病對照組大鼠血糖濃度始終在16.7mmol／L以上，無一血糖下降。
　　結論：
　　通過分離、純化可以獲得大量的新鮮胰島和胰腺導管上皮細胞，大鼠的胰腺導管上皮細胞具有干細胞潛能，在合適的培養(yǎng)條件下早期即能夠轉分化為PDX-1陽性的胰腺干細胞。胰腺干細胞體外可誘導分化為分泌胰島素的胰島樣結構，胰島及胰腺干細胞來源的胰島樣結構序貫移植可有效地糾正糖代謝紊亂對