磷酸鎂骨粘合劑的生物安全性研究.pdf

1、背景：
　　創(chuàng)傷、腫瘤、手術以及骨折不愈合等原因常常造成骨質的缺失，成骨細胞難以爬過間隙而不能發(fā)生正常的愈合過程，最后形成骨不連。人體自身的自體骨具有良好的骨誘導作用，然而受到同種骨和異種骨來源供應的限制。同種異體骨存在傳播疾病的危險和發(fā)生免疫排斥反應的可能，臨床應用受到一定的限制。使用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)骨水泥通過增強內固定物周圍的松質骨達到強化內固定的目的。但是，由于PMM

2、A固化時放熱，不能被機體吸收和重塑，阻礙骨折愈合，這些缺點，大大限制了其臨床應用的范圍。近年來，以磷酸鈣為代表的無機人工骨替代材料的研發(fā)得到很大發(fā)展。
　　華東理工大學劉昌勝教授及其合作者在上海市科委重點項目(98JC14015)資助下，研制成功了可吸收的新型無機骨水泥即磷酸鎂骨水泥(MagnesiumPhosphate Cement，MPC)。通過成果鑒定(滬科鑒02 G00182)研究水平達到國際先進，并已獲得專利。專利授權號

3、為ZL01105373.9；PTC國際專利：PTC/CN01/00282。
　　在市科委的資助下(2003年9月至2006年9月，面上項目，編號為：034119904)，經(jīng)初步研究顯示：MPC粘結強度明顯大于傳統(tǒng)的磷酸鈣骨水泥，可以對細小非負重區(qū)域的骨折片能直接進行粘合；材料同周圍骨質緊密結合，界面處未出現(xiàn)明顯的炎性細胞聚集和纖維膜，未引起異物反應，無內臟毒性，經(jīng)過初步實驗研究結果是滿意的。
　　體內植入材料后，該材料及其代

4、謝產物是否對周圍組織細胞產生影響，是否有遺傳毒性、致癌性和生殖毒性，特別是對成骨細胞的增殖和分化速度產生影響，以及是否對周圍組織的細胞產生致突變的作用也有待于進一步研究。此外其在活體內是否會激活細胞炎性因子，引發(fā)免疫反應異常，目前還沒有確切數(shù)據(jù)，這也將是研究的一個內容。
　　目的：
　　磷酸鎂骨粘合劑自研發(fā)以來，經(jīng)初步研究顯示其粘結強度明顯大于傳統(tǒng)的磷酸鈣骨水泥，可以對細小非負重區(qū)域的骨折片能直接進行粘合；材料同周圍骨質緊密

5、結合，界面處未出現(xiàn)明顯的炎性細胞聚集和纖維膜，未引起異物反應，無內臟毒性。所以MPC的生物學特性，經(jīng)過初步實驗研究結果是滿意的。但對于植入新材料，本課題將研究該材料及其代謝產物是否對周圍組織細胞產生影響，特別是對成骨細胞的增殖和分化速度產生影響，是否對周圍組織的細胞產生致突變的作用，在活體內是否會激活細胞炎性因子，引發(fā)免疫反應異常，符合生物安全性的要求，檢測其生物相容性是否良好。
　　方法：
　　根據(jù)研究目的，本課題分成三個

6、部分。
　　1遺傳毒性試驗：
　　(1)Ames試驗：將磷酸鎂骨粘合劑制備浸提液，采用鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(Ames試驗)，取以生理鹽水為陰性對照，取特定陽性物為陽性組，在添加大鼠肝臟微粒體酶S9的情況和不添加S9的情況下，測試各個組對各種鼠傷寒沙門菌(TA100、TA102、TA97 and TA98)的致突變比值(MR)。致突變比值(MR)=實驗組回變菌落數(shù)(Rt)/陰性對照組回變菌落數(shù)(Rc)，將突變比值做統(tǒng)計分

7、析，觀察MPC浸提液對菌株有無回復突變影響。
　　(2)程序外DNA合成試驗：取人的外周全血，取不同濃度的MPC浸提液做試驗，生理鹽水作為陰性對照組，硫酸鎳為特定陽性組，RPMI1640細胞培養(yǎng)液內加入羥基脲和3H-TdR，共同培養(yǎng)后，震蕩，終止反應后，收集細胞，洗滌、固定、脫水；加入閃爍液，計數(shù)儀上做放射性測量。測試結果用每分鐘放射計數(shù)(cpm)代表DNA合成。
　　(3)微核試驗：取健康成熟昆明雄性小鼠分成三組，不同濃度

8、的MPC浸提液作為試驗組，生理鹽水為陰性對照組，環(huán)磷酰胺為陽性組，在小鼠腹腔內定期注射，間隔24小時，分四次給藥法。提取骨髓腔內嗜多染紅細胞(PCG)，涂片、固定、染色、顯微鏡下計數(shù)微核、計算出現(xiàn)微核的百分比。
　　2體外細胞毒性試驗：
　　(1)四唑鹽比色試驗：簡稱MTT試驗。取第三代小鼠成骨細胞(OB)，制成細胞懸液，不同濃度的MPC浸提液為試驗組，普通細胞培養(yǎng)液為正常對照組，觀察1天、3天、5天后終止，加入MTT和二甲

9、基亞砜(DMSO)，用酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm處測定吸光度(OD)值，計算細胞相對增殖率(RGR)，并分級細胞毒性。
　　(2)堿性磷酸酶(ALP)測定試驗：取第三代小鼠成骨細胞，制成細胞懸液，不同濃度的MPC浸提液為試驗組，酚標準液作為標準組，雙蒸水作為空白組，普通的10％DMEM細胞培養(yǎng)液作為陰性對照組。培養(yǎng)觀察1、3、5天后終止，用堿性磷酸酶試劑盒檢測后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在510nm波長下測定光吸收值，計算酚含量。

10、>　　3細胞炎性因子表達測試試驗：
　　取第三代小鼠成骨細胞，制成細胞懸液，將不同濃度的MPC浸提液作為試驗組，細胞培養(yǎng)液作為陰性對照，用IL-1β、IL-6、TNF-α抗原抗體試劑盒做雙抗體夾心法測定，觀察1、3、5天后終止，底物液顯色，酶標儀450nm處讀數(shù)，繪制曲線圖分析。
　　結果：
　　1在Ames試驗中，TA100、TA102、TA97、TA98菌株陽性對照組回變菌落數(shù)均超過陰性對照組2倍以上(MR>2)；

11、MPC浸提液不同濃度劑量組對菌落平均數(shù)與陰性對照組的比值均小于2(MR<2)；
　　2 UDS試驗中，不同濃度的MPC浸出液的每分鐘放射計數(shù)(CPM)值有濃度依賴性，隨著浸出液的濃度增加，CPM值也逐步增加；不同濃度MPC浸提液的CPM值均遠低于陽性對照組(不同濃度NiSO4)的CMP值；
　　3微核試驗中，環(huán)磷酰胺陽性對照組微核率比陰性組高10多倍，與MPC浸提液組的微核數(shù)值也相差10倍多；不同濃度的MPC微核率，與陰性對

12、照組無顯著差異：不同濃度的微核率不與濃度梯度相應，與生理鹽水陰性組接近，不會引起嗜多染紅細胞的微核率增加；
　　4 MTT試驗中，MPC試驗組小鼠成骨細胞相對增殖率(RGR)在1、3、5天時分別為87.37％～115.13％、98.96％～118.96％和88.46％～108.92％；細胞毒性分級均為0或1級；不同濃度的MPC浸出液對細胞生長無明顯影響；
　　5 ALP檢測試驗，隨著浸提液濃度的提高，ALP值有所下降；不同濃

13、度的MPC浸提液的ALP值與陰性對照組相比，統(tǒng)計學上無明顯差異性，不會影響成骨細胞正常生長。
　　6細胞炎性因子表達測定試驗，隨著浸提液濃度的提高，炎性因子的表達沒有顯著增加；不同濃度的MPC浸提液與陰性對照組相比，統(tǒng)計學上無明顯差異性，分子水平不會促進炎性因子的表達。
　　結論：
　　1磷酸鎂骨粘合劑不會引起鼠傷寒沙門菌的回復突變數(shù)增加，不會引起基因改變；
　　2磷酸鎂骨粘合劑浸出液對DNA無損傷作用；