鴨腸炎病毒編碼microRNAs靶基因的預(yù)測(cè)及dev-miR-D13-5p對(duì)病毒增殖影響的初步研究.pdf

1、鴨腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，又稱鴨瘟病毒(duck plague virus, DPV)，是一種導(dǎo)致鴨高傳染性、高死亡率的α-皰疹病毒。microRNA(miRNA)為內(nèi)源性的非編碼單鏈小RNA分子，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸，通過(guò)與靶基因mRNA相互作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在調(diào)節(jié)病毒生活周期、促細(xì)胞存活、免疫逃避和腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用。鴨腸炎病毒編碼成熟的miRNAs，但對(duì)其調(diào)控機(jī)制我們卻未見(jiàn)報(bào)道。本文利

2、用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了鴨腸炎病毒編碼的33個(gè)miRNAs靶基因，并對(duì)dev-miR-D13-5p部分靶基因進(jìn)行了驗(yàn)證及其對(duì)病毒增殖的影響進(jìn)行了探討，結(jié)果報(bào)道如下:
　　1.DEV miRNAs靶基因的預(yù)測(cè)
　　通過(guò)生物信息學(xué)軟件RNAhybrid、miRanda和Targetscan預(yù)測(cè)33個(gè)DEV miRNAs的靶基因，得到其可能潛在調(diào)節(jié)40多個(gè)DEV基因和900多個(gè)宿主基因。利用Cytoscape軟件繪制DEV miRN

3、As和宿主mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)。為了更進(jìn)一步探索DEV miRNAs的功能，Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)下載宿主靶基因的GO(Gene Ontology)注釋，WEGO生成宿主靶基因GO分類注釋圖，GO分析揭示902個(gè)宿主靶基因映射到42個(gè)GO分類，包括11個(gè)細(xì)胞組分、10個(gè)分子功能和21個(gè)生物學(xué)過(guò)程;另外，DAVID分析宿主靶基因的KEGG通路，902個(gè)宿主基因只有一小部分富集于11個(gè)信號(hào)通路，其中MAPK信號(hào)通路富集基因最多。
　　2

4、.dev-miR-D13-5p靶基因的驗(yàn)證
　　為了探究DEV miRNA對(duì)病毒增殖的影響，選擇與病毒復(fù)制靶基因UL8(OPF)和UL93'UTR緊密相關(guān)的dev-miR-D13-5p為研究對(duì)象。本研究首先成功構(gòu)建dev-miR-D13-5p靶基因雙熒光素酶報(bào)告基因野生型載體pmirGLO-UL8(wt)和突變型載體pmirGLO-UL8(mut)，然后dev-miR-D13-5p mimic、NC mimic分別與靶基因野生型和

5、突變型載體共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，48 h后檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性，并計(jì)算兩者熒光素酶活性的比值，結(jié)果野生型試驗(yàn)組(0.3076±0.0289)和對(duì)照組(0.4753±0.0497)相比，差異極顯著(P＜0.01);突變型試驗(yàn)組(0.4119±0.0147)和對(duì)照組(0.4582±0.0435)相比，差異不顯著(P＞0.05);野生型試驗(yàn)組(0.3076±0.0289)和突變型試驗(yàn)組(0.4119±0.0147)相比，差異

6、極顯著(P＜0.01)。表明dev-miR-D13-5p能與UL8(ORF)或UL93'UTR相互作用。
　　3.dev-miR-D13-5p對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄水平和病毒增殖的影響
　　構(gòu)建dev-miR-D13-5p靶基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-UL8(ORF)和pcDNA3.1(+)-UL9(ORF+3'UTR)，分別將dev-miR-D13-5p mimic、NC mimic與pcDNA3.1(+)-UL8(O

7、RF)和pcDNA3.1(+)-UL9(ORF+3'UTR)共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，48 h后分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)UL8、UL9基因的水平，探討dev-miR-D13-5p mimic對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，dev-miR-D13-5p mimic組UL8 mRNA的表達(dá)量下調(diào)79.91％，方差分析差異極顯著(P＜0.01); dev-miR-D13-5pmimic組UL9 mRNA的表達(dá)量幾乎無(wú)變

8、化，方差分析差異不顯著(P＞0.05)。據(jù)此表明dev-miR-D13-5p能抑制UL8 mRNA水平，但對(duì)UL9 mRNA水平影響不顯著。
　　為探究dev-miR-D13-5p對(duì)病毒增殖的影響，將鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF, duckembryo fibroblast)接種至24孔培養(yǎng)板中，一段時(shí)間后轉(zhuǎn)染dev-miR-D13-5p mimic、NC mimic，轉(zhuǎn)染12h后感染DEV，并于感染DEV后24h、48h及72h后收集

9、細(xì)胞病毒液，絕對(duì)熒光定量法檢測(cè)DEV DNA的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，24 h和48 h時(shí)dev-miR-D13-5p mimic組（24 h,5.19×104 copies/μl;48h,1.54×105 copies/μl）與NC mimic組(24 h，4.83×104 copies/μl;48h，2.28×105copies/μl)相比，差異均不顯著(P＞0.05);72 h時(shí)，dev-miR-D13-5p mimic組(5.86×1