鴨瘟病毒gC基因介導的宿主細胞吸附特性及gC--TK-雙基因缺失株構建.pdf

1、鴨瘟是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，該病對鴨、鵝、天鵝等造成的高發(fā)病率和高死亡率特征使其嚴重危害水禽業(yè)發(fā)展。本研究工作目的在于明確鴨瘟病毒(DPV)gC基因介導對宿主細胞的吸附特性，以及構建鴨瘟病毒gC-/TK-雙基因缺失病毒株。主要研究內容和結果如下:
　　1.鴨瘟病毒gC介導的吸附感染宿主細胞特性研究
　　通過比較實驗室前期構建的重組鴨瘟病毒gC缺失株(DPV-ΔgC-EGFP)與親本株(DPV-CHv)對鴨胚成纖維

2、細胞(DEF)吸附能力的差異及細胞表面硫酸乙酰肝素(HS)在其中的作用，探討鴨瘟病毒gC介導的吸附感染宿主細胞的特性。
　　首先，建立基于EGFP基因定量PCR檢測DPV-ΔgC-EGFP和基于gC基因定量PCR檢測DPV-CHv病毒DNA拷貝數的方法，檢測病毒在DEF不同吸附時間和吸附1h后不同增殖時間病毒DNA拷貝數的差異，分析gC基因對病毒吸附的影響。結果DPV-ΔgC-EGFP和DPV-CHv均隨著時間的延長病毒吸附量增加

3、且于90 min時病毒吸附含量達峰值而穩(wěn)定，各時間點DPV-CHv吸附細胞的病毒量均高于DPV-ΔgC-EGFP，吸附90 min后兩種病毒含量差異不顯著，但吸附60 min時DPV-CHv病毒量極顯著高于DPV-ΔgC-EGFP;吸附1h后DPV-ΔgC-EGFP和DPV-CHv均隨增殖時間的延長病毒含量增加，增殖74 h以內的各時間點病毒含量差異不顯著，但增殖74 h時DPV-CHv的病毒含量顯著高于DPV-ΔgC-EGFP，表明g

4、C與DPV吸附有關且主要在病毒吸附前期發(fā)揮作用。
　　然后，將DPV-ΔgC-EGFP和DPV-CHv的病毒與不同濃度的肝素(Heparin)于37℃作用1h再接種DEF細胞及將不同濃度的肝素酶37℃1h處理DEF細胞后再將病毒接種DEF細胞，定量PCR檢測DPV-ΔgC-EGFP和DPV-CHv吸附感染DEF細胞病毒DNA拷貝數的變化。結果無論是Heparin與病毒作用后還是肝素酶處理細胞后DPV-ΔgC-EGFP和DPV-CH

5、v病毒吸附感染DEF細胞的病毒量均并無顯著性差異，表明肝素抑制病毒結合細胞表面HS以及肝素酶降解細胞表面HS后均不影響gC缺失株和親本株病毒對DEF細胞的吸附感染，即DPV不依賴于HS吸附到DEF細胞。
　　同時利用肝素層析柱HiTrap Heparin HP對透析復性的原核表達DPV-gC重組蛋白進行親和層析，并設置原核表達的DPV-gB重組蛋白作陽性對照、原核表達的DPV-gE重組蛋白作陰性對照，以SDS-PAGE以及west

6、ern blot檢測各重組蛋白與HS的特異性結合力。結果表明DPV-gB能特異性結合HS，而DPV-gC與DPV-gE不能特異性與HS結合。綜上表明，DPV gC不是通過與細胞表面HS結合而介導病毒吸附，且gC影響病毒的吸附主要在前期發(fā)揮作用，對病毒后期吸附的總量并無影響。
　　2.鴨瘟病毒gC-/TK-雙基因缺失株構建及部分生長特性
　　根據gC和TK基因是皰疹病毒復制非必需基因且與病毒毒力有關，在實驗室前期構建的TK缺失

7、的細菌人工染色體重組鴨瘟病毒DPV CHv-BAC-G的基礎上，利用大腸桿菌細胞內Red重組技術構建DPV gC-/TK-雙基因缺失株DPV CHv-BAC-GΔgC及其gC回復突變株DPV CHv-BAC-GΔgCR，PCR、RFLP和IFA鑒定結果表明，成功獲得鴨瘟病毒gC-/TK-雙基因缺失株及其gC回復突變病毒株。測定DPV CHv-BAC-GΔgC與DPVCHv-BAC-GΔgCR的部分體外生長特性，將病毒感染DEF細胞，用0

8、.5％甲基纖維素固定病毒蝕斑的大小和形狀并用0.5％結晶紫染色，觀察比較蝕斑大小，結果CHv-BAC-G和CHv-BAC-GΔgCR感染宿主細胞DEF后形成的空斑大小接近、形態(tài)相似，但CHv-BAC-GΔgC形成的空斑顯著減小，表明gC可影響病毒空斑的大小。將等量病毒DNA拷貝數的CHv-BAC-G、CHv-BAC-GΔgC和CHv-BAC-GΔgCR分別接種到DEF細胞，定量PCR方法檢測接種后0～120 h不同增殖時間細胞和上清中的