端粒酶抑制對(duì)肝癌細(xì)胞黏附和侵襲的影響.pdf

1、背景和目的:原發(fā)性肝癌主要是肝細(xì)胞癌,是一種惡性程度和病死率均較高的臨床常見腫瘤,其主要生物學(xué)特性是侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差。目前,手術(shù)、放療、化療等各種治療方法由于各自的局限性效果都不甚理想。因此,探索出新的有效的抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的方法具有重要的臨床意義。端粒酶是目前特異性較高、應(yīng)用較廣的腫瘤標(biāo)志物之一,端粒酶活性的高低不僅與細(xì)胞的增殖有關(guān),而且與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。端粒酶如何調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,其機(jī)制尚不清楚。因此

2、,以端粒酶為靶點(diǎn)的腫瘤基因治療成為目前抗癌治療研究的熱點(diǎn)。本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體,將反義人端粒酶RNA基因?qū)肴烁伟┘?xì)胞系BEL-7402中,觀察肝癌細(xì)胞黏附和侵襲能力的變化及與肝癌細(xì)胞黏附和侵襲密切相關(guān)的蛋白的表達(dá)變化,從而探討反義人端粒酶RNA基因?qū)Ω伟┘?xì)胞系BEL-7402黏附和侵襲的作用及其作用的機(jī)制,為臨床肝癌的治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法:前期實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了攜帶正、反義人端粒酶RNA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒PLXS

3、N-hTR,經(jīng)電穿孔將質(zhì)粒導(dǎo)入PT67包裝細(xì)胞及重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人肝癌細(xì)胞系BEL-7402等一系列過程,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的人肝癌細(xì)胞克隆。成功轉(zhuǎn)染正、反義端粒酶RNA基因的肝癌細(xì)胞分別為正義轉(zhuǎn)染組(BEL-7402-hTR-EeoRI)和反義轉(zhuǎn)染組(BEL-7402-hTR-BamHI),同時(shí)將未做任何處理的肝癌細(xì)胞BEL-7402作為空白對(duì)照組(BEL-7402)。三組細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng),人工基底膜黏附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞黏附能力的變化

4、,體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力的變化,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測不同處理組細(xì)胞整合素β1(INTβ1)、上皮型鈣黏蛋白(E-cad)的表達(dá)水平,明膠酶譜法分析細(xì)胞MMP-2和MMP-9的活性變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.人工基底膜黏附實(shí)驗(yàn)MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義轉(zhuǎn)染組、正義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組細(xì)胞的黏附率分別為48.75％、75.73％、79.50％,與空白對(duì)照組和正義轉(zhuǎn)染組相比,反義轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的黏附能力明顯減低,正義轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)

5、照組間黏附力無明顯差異。
　　 2.體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示反義轉(zhuǎn)染組、正義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為34.80±3.19、69.87±3.11、71.47±5.15,反義轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于正義轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組,正義轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)無明顯差異。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)圖像分析結(jié)果示,反義轉(zhuǎn)染組、正義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組細(xì)E-cad的表達(dá)水平分別為:0.2092±0.0196、0.1340±0.

6、0158、0.1244±0.0177,INTβ1的表達(dá)水平分別為:0.1533±0.0156、0.3747±0.0144、0.3846±0.0081,與空白對(duì)照組和正義轉(zhuǎn)染組相比,反義轉(zhuǎn)染組E-cad的表達(dá)水平明顯增強(qiáng),INTβ1的表達(dá)水平明顯減低,正義轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組相比,兩種蛋白的表達(dá)均無明顯差異。
　　 4.明膠酶譜法結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清中MMP-9和MMP-2活性顯著低于正義轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組,且各組細(xì)胞MMP-