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1、目的:研究用纖溶酶免疫獲得的抗纖溶酶抗體是否可以結(jié)合其他抗磷脂抗體相關(guān)的自身抗原以及抗纖溶酶抗體的致病性。方法:用天然的人纖溶酶免疫小鼠,獲得免疫的小鼠血清和制備并純化出10株抗纖溶酶單克隆抗體,用固相酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)免疫小鼠血清及單抗對(duì)纖溶酶、心磷脂、p2糖蛋白I、活化蛋白C、凝血酶和組織型纖溶酶原活化物(t-PA)的識(shí)別,檢測(cè)了單抗對(duì)凝血時(shí)間的影響。單抗5E9和5C5用于誘導(dǎo)BALB/c小鼠的流產(chǎn)模型,用抗C3b/C
2、3c抗體行免疫組化檢測(cè)活化補(bǔ)體對(duì)胎盤的損傷作用。結(jié)果用纖溶酶免疫獲得的10份小鼠血清中,可以識(shí)別纖溶酶(10/10)、心磷脂(5/10)、p2糖蛋白I(7/10)、活化蛋白C(6/10)、凝血酶(3/10)和組織型纖溶酶原激活劑(5/10)。在所有的10株單克隆抗纖溶酶抗體中,1株與p2糖蛋白I和凝血酶,1株結(jié)合活化蛋白C,1株結(jié)合t-PA,在胎牛血清封閉的心磷脂檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中有三株對(duì)心磷脂有結(jié)合能力。單抗5E9能延長(zhǎng)部分凝血活酶(APTT
3、)時(shí)間,并被dRVVT試驗(yàn)所矯正,呈現(xiàn)狼瘡抗凝物特性;5C5和5F10能降低纖溶酶的水解活性。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,單抗5E9和5C5能增加孕鼠的死胎率,5E9和5C5單抗均能降低小鼠的胎盤和胎鼠的重量,免疫組化顯示了這兩株抗纖溶酶抗體處理后的小鼠胎盤的絨毛膜和蛻膜的問質(zhì)血管有活化的補(bǔ)體C3沉積。結(jié)論纖溶酶是一種新的抗磷脂抗體的靶抗原,纖溶酶可能與其他參與凝血和纖溶的分子存在共同抗原表位,導(dǎo)致了抗纖溶酶抗體與p2糖蛋白I、活化蛋白C、凝血酶和t
4、-PA之間的交叉反應(yīng)。本文提示抗纖溶酶抗體在體內(nèi)、外均可促進(jìn)血栓的形成,且發(fā)病過程有補(bǔ)體活化途徑參與。 第二章 抗纖溶酶抗體識(shí)別抗原的結(jié)構(gòu)域的研究 印跡法檢測(cè)了病人來源的單克隆抗體CLl5和多抗血清對(duì)不同結(jié)構(gòu)域的識(shí)別。結(jié)果成功克隆了纖溶酶的6個(gè)結(jié)構(gòu)域,并獲得純化的原核表達(dá)蛋白質(zhì)。其中5個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域獲得可溶性表達(dá),SPD為包含體表達(dá)。CLl5和24.1%(13/54)病人多抗主要識(shí)別的結(jié)構(gòu)域是SPD。結(jié)論
5、原核表達(dá)并純化表達(dá)了6個(gè)纖溶酶結(jié)構(gòu)域,并證實(shí)APS病人中的自身抗體主要識(shí)別SPD結(jié)構(gòu)域。 第三章 抗纖溶酶抗體表位的生物信息學(xué)分析 目的:運(yùn)用生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)分析高親和力抗纖溶酶單抗CLl5的表位,并鑒定其所識(shí)別的主要表位肽。方法根據(jù)CLl5的抗體的抗原決定簇CDR區(qū)的已知序列,在PBD蛋白庫(kù)中進(jìn)行同源比較,獲得了同源性較高的單抗1MFA的Fab段的晶狀結(jié)構(gòu),用計(jì)算機(jī)軟件把CLl5的CDR區(qū)序列優(yōu)化進(jìn)入
6、1MFA后,根據(jù)結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)與CLl5進(jìn)行對(duì)接。獲得CLl5和纖溶酶絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(serineprotease domain,SPD)的相互作用的結(jié)構(gòu),并計(jì)算它們之間的相互作用能量,結(jié)合已知的信息和對(duì)SPD的表位預(yù)測(cè)結(jié)果,設(shè)計(jì)了3段在酶活性中心附近的抗原表位肽。并檢測(cè)了單抗對(duì)表位肽的結(jié)合能力和多肽對(duì)CLl5結(jié)合纖溶酶的抑制效應(yīng)。結(jié)果通過對(duì)CLl5的晶體結(jié)構(gòu)的同源模建,計(jì)算機(jī)模擬與SPD結(jié)合,CLl5在纖溶酶的酶活性區(qū)的606~
7、789中的部分氨基酸序列有明顯的相互作用,存在表位為空間構(gòu)象,能將纖溶酶的SPD活性中心屏蔽。在對(duì)所設(shè)計(jì)的表位肽A629-644的結(jié)合試驗(yàn)中,CLl5能結(jié)合該肽,并且合成肽能部分抑制CLl5與纖溶酶的結(jié)合。結(jié)論生物信息學(xué)的方法是進(jìn)行表位分析的有力手段。單抗CLl5的結(jié)合主要表位在纖溶酶的絲氨酸的活性中心區(qū)域附近,能阻斷或影響絲氨酸蛋白酶的活性中心的關(guān)鍵氨基酸,降低纖溶酶的活性,可能是最終導(dǎo)致抗磷脂綜合征病人血栓形成的原因之一。
8、 目的:建立CLl5識(shí)別的肽抗原檢測(cè)抗纖溶酶抗體的檢測(cè)方法,在APS病人中檢測(cè)抗纖溶酶抗體和抗纖溶酶單克隆抗體CLl5識(shí)別的肽抗原抗體,比較這兩種檢測(cè)方法的相關(guān)性,初步評(píng)估抗CLl5識(shí)別的肽抗原抗體的臨床意義。方法收集了自2002年以來在我院就診的54例APS病人,并收集了25例正常人和28例SLE患者作為對(duì)照,用ELISA方法檢測(cè)了抗纖溶酶抗體、抗合成肽抗原抗體、抗心磷脂抗體和抗β 2糖蛋白1抗體,分析了以天然纖溶酶包被的抗纖溶酶抗體
9、和基于單抗CLl5識(shí)別的合成肽抗原包被的抗纖溶酶抗體的ELISA檢測(cè)兩種方法的相關(guān)性。結(jié)果37%(20/54)的APS病人有IgG型抗纖溶酶抗體,31.5%(17/54)的病人存在IgG型抗合成肽抗體,較對(duì)照組有顯著差異(P
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