腺病毒載體介導(dǎo)siRNA干擾VEGF-C表達(dá)抑制結(jié)腸癌淋巴管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶有RNA干擾片段的腺病毒載體Ad5F35-VEGF-CsiRNA-EGFP，在體外，觀察其對人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞株VEGF-C表達(dá)的抑制效果；在體內(nèi)，探討人結(jié)腸癌BALB/c裸鼠皮下瘤模型瘤內(nèi)注射腺病毒載體Ad5F35-VEGF-CsiRNA-EGFP對腫瘤生長及瘤內(nèi)淋巴管生成的抑制效果。 方法：體外實(shí)驗(yàn)：選擇針對人VEGF-C mRNA的特異性siRNA靶序列，設(shè)計(jì)合成其相應(yīng)的雙鏈DNA，利用BamHI、Hind

2、III雙酶切插入pDC316-EGFP-U6載體后構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pDC316-VEGF-C siRNA-EGFP-U6，再與骨架質(zhì)粒pBHGF35共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，同源重組，酶切鑒定，包裝擴(kuò)增后得到重組腺病毒Ad5F35-VEGF-CsiRNA-EGFP-U6，Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP-U6轉(zhuǎn)染人結(jié)腸腺癌LOVO細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，熒光顯微鏡下計(jì)算腺病毒轉(zhuǎn)染效率，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反(RT-PCR)和蛋白印跡(

3、Western-blot)分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測其對VEGF-C表達(dá)的抑制效果；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：裸鼠皮下注射LOVO細(xì)胞構(gòu)建人結(jié)腸癌皮下瘤模型24只，隨機(jī)分為4組(每組6例)，以腺病毒、空病毒、裸siRNA以及PBS分別進(jìn)行瘤內(nèi)原位注射干預(yù)，計(jì)算腫瘤體積變化并繪制生長曲線，使用抗CD34單抗和抗LYVE-1單抗分別染色瘤內(nèi)的血管和淋巴管，檢測瘤內(nèi)血管和淋巴管生成情況，并計(jì)算微血管密度(MVD)、微淋巴管密度(LVD)。 結(jié)論：