HLA-A2限制性survivin點突變抗原肽特異性TCR基因篩選及抗腫瘤功能驗證.pdf

1、目的:通過HLA-A2限制性survivin點突變抗原肽(Sur79M2)體外刺激T淋巴細(xì)胞,篩選特異性識別Sur79M2的TCR基因。構(gòu)建TCR基因雙表達(dá)載體,包裝重組嵌合型腺病毒并轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞,研究轉(zhuǎn)Sur79M2特異性TCR基因T細(xì)胞的抗腫瘤功能,為今后點突變腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的特異性T細(xì)胞過繼性腫瘤治療新方法和新型靶點TCR基因治療藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　一.分離HLA-A2+健康人外周血單個核細(xì)胞(P

2、BMC),體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞,成熟DC細(xì)胞負(fù)載Sur79M2與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),對照組DC未負(fù)載Sur79M2與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞抗原受體(TCR)Vβ亞家族表達(dá)譜。
　　二.多重基因分析系統(tǒng)Gexp檢測Sur79M2刺激的實驗組及對照組T細(xì)胞抗原受體(TCR)Vα和Vβ亞家族表達(dá)格局。
　　三.提取實驗組RNA,克隆Sur79M2特異性TCRVα和Vβ基因,構(gòu)建重組嵌合型腺病毒穿梭質(zhì)粒p315 TCRVα

3、-IRES-Vβ。
　　四.通過Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法,將腺病毒骨架質(zhì)粒與構(gòu)建的腺病毒穿梭質(zhì)粒p315 TCRVα-IRES-Vβ共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,包裝表達(dá)目的基因的重組腺病毒。獲得的初病毒提取病毒基因組DNA,PCR擴(kuò)增目的基因及腺病毒骨架質(zhì)粒纖毛基因進(jìn)行鑒定。病毒轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞,檢測目的基因的轉(zhuǎn)染效率。將鑒定正確的重組嵌合型腺病毒大量擴(kuò)增,過濾TCID50法測病毒滴度。
　　五.腺病毒轉(zhuǎn)

4、染PBMC36小時后,分別作T2細(xì)胞負(fù)載Sur79M2(HLA-A2+、Survivin+)、肝癌細(xì)胞株HepG2(HLA-A2+、Survivin+)、乳腺癌細(xì)胞株Mcf-7(HLA-A2+、Survivin+)、肝癌細(xì)胞株7402(HLA-A2-、Survivin+)及肺癌細(xì)胞株NCI-H1299(HLA-A2-、Survivin-),12h、24h、36h三個時間點MTT檢測殺傷效果及Elisa法檢測IFN-γ的分泌。
　　

5、結(jié)果:經(jīng)DC負(fù)載Sur79M2刺激的PBMC流式檢測TCRVβ亞家族表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)TCRVβ7.1亞家族表達(dá)明顯升高,而Gexp檢測TCRVα和Vβ基因表達(dá)顯示TCRVα4和Vβ7基因出現(xiàn)單一主峰的寡克隆峰圖?？寺CRVα4和Vβ7基因后測序分析CDR3序列證實TCRVα4和Vβ7基因發(fā)生了克隆增殖現(xiàn)象。構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒p315-TCRVα4-IRES-Vβ7,包裝重組嵌合型腺病毒,并從病毒中擴(kuò)增出目的基因。重組嵌合型腺病毒轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)

6、胞后流式檢測能有效檢測到目的基因的表達(dá)。MTT法檢測殺傷效率依次為T2負(fù)載肽>HepG2(HLA-A2+、Survivin+)>Mcf-7(HLA-A2+、Survivin+)>7402(HLA-A2-、Survivin+)>NCI-H1299(HLA-A2-、Survivin-),IFN-γ的分泌情況幾乎與MTT殺傷效率一致。
　　結(jié)論:通過DC負(fù)載Sur79M2體外刺激T淋巴細(xì)胞的方法,成功篩選到Sur79M2特異性TCRVα