納米羥基磷灰石-殼聚糖復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞粘附行為的初步觀察.pdf

1、羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)是人體和動(dòng)物骨骼、牙齒的主要無機(jī)成分，在骨質(zhì)中，HA大約占60％。人工合成的HA與人體正常骨的磷灰石結(jié)晶相似，具有良好的生物活性和生物相容性，植入人體后能在短時(shí)間內(nèi)與人體的軟硬組織形成緊密結(jié)合，為新骨的沉積與再生提供優(yōu)良的生理支架，因此，HA作為一種生物性能優(yōu)越的骨替代材料被廣泛應(yīng)用于臨床。尤其納米尺寸的羥基磷灰石(nanoscale panicleofhydroxyapatite，nHA

2、)因具有納米材料特有的表面效應(yīng)，小尺寸效應(yīng)(又稱體積效應(yīng))等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)不同領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但是由于陶瓷材料的脆性，難成型等特點(diǎn)限制了它的應(yīng)用。復(fù)合材料是指一個(gè)宏觀或微觀的尺寸范圍內(nèi)，含有兩種或多種不同成分或不同相的材料。復(fù)合材料既能保留原組成材料的主要特性，又能通過復(fù)合效應(yīng)獲得原組分所不具備的性能。可以通過材料設(shè)計(jì)使各組分的性能互相補(bǔ)充并彼此關(guān)聯(lián)，從而獲得新的優(yōu)越性能，因此復(fù)合材料的應(yīng)用領(lǐng)域正在逐步增加。將HA與天然或人工合成的

3、高分子材料復(fù)合得到的新型復(fù)合材料一方面與自然骨的結(jié)構(gòu)更相似，同時(shí)又避免了HA顆粒易流失和脆性大的不足。 殼聚糖(chitosan，CS)是一類重要的堿性天然多糖，它由甲殼素(chitin)經(jīng)脫乙?；磻?yīng)而得，在自然界中廣泛存在于低等生物菌類，在體內(nèi)最終代謝產(chǎn)物為N-乙酰葡萄糖和氨基多糖，是天然代謝產(chǎn)物，對(duì)機(jī)體無害。它良好的塑形性及可加工性賦予CS復(fù)合物優(yōu)良的理化特性。目前已成功地用作手術(shù)縫合線、傷口敷料、藥物緩釋劑、缺損填充物及

4、組織工程支架等。本研究首先制備nHA，然后將nHA與CS復(fù)合，并對(duì)該復(fù)合材料進(jìn)行檢測(cè)分析，然后將復(fù)合材料與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察該復(fù)合材料對(duì)成纖維細(xì)胞粘附行為的影響，評(píng)估其生物相容性。 第一部分納米羥基磷灰石-殼聚糖復(fù)合材料的制備及檢測(cè)分析。 材料和方法:采用溶膠-凝膠(sol-gel)法，以四水硝酸鈣和磷酸三甲酯分別作為鈣和磷的前驅(qū)體，制備HA。在前驅(qū)溶液中加入檸檬酸(citric acid，CA)作螯合劑，制備nHA

5、。冷凍干燥法制備nHA/CS復(fù)合材料，并對(duì)材料進(jìn)行x射線衍射(X-ray diffraction，XRD)，傅里葉變換紅外光譜(Fourier transformed infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)，掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)分析。 結(jié)果:1．XRD分析結(jié)果

6、表明溶膠-凝膠法制備的HA和nHA的晶體結(jié)構(gòu)符合標(biāo)準(zhǔn)HA的空間六方晶體結(jié)構(gòu)。2．TEM分析結(jié)果表明復(fù)合材料中HA為納米級(jí)顆粒；電子衍射分析顯示HA為晶體結(jié)構(gòu)。3．SEM下冷凍干燥法制備的復(fù)合材料和單純CS支架表面結(jié)構(gòu)相似，都為多孔材料，能量色散X線分析(energy dispersive x-ray analysis，EDAX)顯示出兩種材料成分的變化；復(fù)合材料中nHA在CS基質(zhì)中分散比較均勻。4．在紅外區(qū)存在HA，nHA和CS的主要官

7、能團(tuán)，沒有新的吸收峰值出現(xiàn)，表明nHA和CS在復(fù)合物中都存在，但兩種特征峰僅僅是簡(jiǎn)單的疊加，二者未發(fā)生明顯的化學(xué)反應(yīng)。 結(jié)論:采用sol-gel法，以CA作為螯合劑，可以制備出nHA。冷凍干燥法復(fù)合nHA與CS得到的復(fù)合材料中，兩種物質(zhì)在復(fù)合物中都存在，二者未發(fā)生明顯的化學(xué)反應(yīng)，各自保持本身材料的完整性。 第二部分納米羥基磷灰石-殼聚糖復(fù)合膜對(duì)成纖維細(xì)胞的粘附作用。 材料和方法:制備2％CS/nHA復(fù)合膜和2％C

8、S/HA復(fù)合膜，然后將兩組膜分別與NIH3T3細(xì)胞共培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察NIH3T3細(xì)胞在復(fù)合材料表面粘附形態(tài)同時(shí)進(jìn)行粘附數(shù)量的測(cè)定。 結(jié)果: 1．倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞貼壁伸展良好，共培養(yǎng)3天，5天，7天后兩種復(fù)合膜上及膜旁邊各處均有細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形或多角型，胞體透明。2．細(xì)胞粘附數(shù)量顯示共培養(yǎng)3天后，nHA/CS膜組細(xì)胞粘附數(shù)量與HA/CS組無顯著性差別，但是共培養(yǎng)5天，7天后nHA/CS組細(xì)胞粘附數(shù)量高于HA/CS組

9、，差異有顯著性(p<0.05)。 結(jié)論: 2％CS/nHA與2％CS/HA膜都為半透明的，可以直接在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)中，兩組膜上細(xì)胞貼壁，伸展情況良好。5天、7天后nHA/CS膜組細(xì)胞粘附數(shù)量高于HA/CS組，說明nHA相比致密HA有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。 第三部分成纖維細(xì)胞在多孔納米羥基磷灰石-殼聚糖三維立體支架材料上的粘附觀察。 材料與方法:冷凍干燥法制備2％CS/nHA復(fù)合支架，將致密HA制

10、成與2％CS/nHA復(fù)合支架同樣大小的圓盤狀，然后將NIH3T3細(xì)胞與兩組材料置于培養(yǎng)板共培養(yǎng)5、7、9天后，掃描電鏡觀察細(xì)胞在兩種材料表面的粘附形態(tài)同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞粘附數(shù)量的測(cè)定和能譜分析。 結(jié)果: 1．倒置顯微鏡下觀察nHA/CS復(fù)合支架組培養(yǎng)液澄清，材料周圍細(xì)胞呈梭形或多角型，胞體透明。致密HA組培養(yǎng)液中有少量HA顆粒從盤狀HA片中游離，但是HA顆粒并沒有影響細(xì)胞生長(zhǎng)。2．SEM下致密HA觀察結(jié)果：電鏡下見細(xì)胞以多個(gè)突起粘附于

11、材料表面，并具有良好的伸展?fàn)顟B(tài)。3．SEM下nHA/CS觀察結(jié)果及EDAx分析：電鏡下見細(xì)胞以多個(gè)突起粘附于材料表面，伸展良好，可見細(xì)胞爬過孔的表面。高倍鏡下EDAX分析顯示無細(xì)胞粘附的材料表面和有細(xì)胞粘附的材料表面的化學(xué)成分的變化，其中碳的含量從47.07％增加到57.81％，而鈣的含量從10.27％下降到1.09％。 4．與NIH3T3細(xì)胞共培養(yǎng)5天，7天，9天后nHA/CS材料表面的細(xì)胞粘附數(shù)量高于致密HA組，差異有顯著性(p<0