播散性念珠菌病小鼠腎臟中HSP90及TLR4表達及相關性研究.pdf

1、目的:播散性念珠菌病發(fā)病與機體的天然免疫和特異性免疫有關。尤其是天然免疫在發(fā)病中的作用越來越受到重視。TLRs是宿主識別各種病原體相關分子模式，并激活和調節(jié)天然免疫-適應性免疫反應的一類模式識別受體。白念珠菌表面的特征性糖磷脂甘露聚糖可被TLR4識別，通過誘導前炎性細胞因子的釋放及促進中性粒細胞的聚集等來介導宿主的抗真菌免疫反應。熱休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)是一類在生物進化中高度保守且廣泛存在于原核及真核生物中

2、的蛋白質，加熱、缺氧、感染、氧化劑等刺激因素都可誘導其表達增加。HSP除參與機體的氧化應激反應外，還參與機體的天然免疫過程。HSP90是近年來研究與白念珠菌感染密切相關的一類分子。有研究顯示HSP細胞因子的效應是通過TLR2和TLR4信號途徑，導致NF-KB因子和MAPK激酶的激活實現(xiàn)的。本研究通過建立播散性念珠菌病感染小鼠動物模型，探討HSP90及TLR4在播散性念珠菌病小鼠腎臟的表達及HSP90及TLR4表達的相關性，探討其在播散性

3、念珠菌病發(fā)病的免疫機制，為免疫及生物治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.實驗菌株白念珠菌，來源于河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院皮膚性病科真菌檢查室保存菌種。
　　 2.建立播散性念珠菌病小鼠模型
　　 昆明小鼠90只，清潔級，雌雄各半，5～6周齡，20～259，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。經(jīng)過適應環(huán)境，按體重隨機分成A、B、C三組，每組小鼠各30只。A組為實驗組:在實驗的第1天通過腹腔注射200mg/k

4、g·d環(huán)磷酰胺，連續(xù)4天，第5天時，經(jīng)腹腔注射白念珠菌菌懸液0.2mL/只，菌懸液的濃度是1～5×106cfu/mL，共1天。B組環(huán)磷酰胺對照組:在實驗的第1天經(jīng)腹腔連續(xù)4天注射同等量的環(huán)磷酰胺，第5天時，經(jīng)腹腔注射生理鹽水0.2mL/只，共1天。C組空白對照組:在實驗第1天經(jīng)腹腔連續(xù)5天注入同等量的生理鹽水。分別于實驗第6天、第9天、第20天分三批處死小鼠，觀察小鼠腹腔內(nèi)部臟器大體情況。
　　 3.鑒定播散性念珠菌感染小鼠腎臟

5、菌株
　　 無菌條件下解剖小鼠取出腎臟，用無菌生理鹽水沖洗腎臟組織數(shù)次，將小鼠1/2腎臟組織研磨，在沙氏培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)。
　　 4組織病理學檢查和免疫組化檢測
　　 剩余腎臟組織用10％福爾馬林固定，進行常規(guī)病理HE染色和PAS染色，觀察小鼠腎組織白念珠菌感染情況和病理變化。運用免疫組織化學方法（鏈霉菌抗生素蛋白——過氧化物酶連接法SP）檢測HSP90和TLR4的表達情況。
　　 結果:
　　

6、1.建立播散性念珠菌病感染小鼠模型
　　 實驗過程中，小鼠由于注射環(huán)磷酰胺免疫抑制劑造成多個臟器水腫、出血共死亡11只;由于白念珠菌播散感染共死亡12只;不明原因共死亡13只。最后，納入實驗的總計54只小鼠。A組小鼠在實驗第6d，飲食和精神稍差，毛發(fā)沒有光澤，呼吸正常。解剖小鼠見腹腔內(nèi)部分臟器明顯水腫，未見白色膿點形成;實驗第9d，解剖小鼠見腹腔內(nèi)各臟器白色膿點形成;實驗第20d，解剖小鼠見腹腔內(nèi)各臟器大量白色膿點形成，部分臟器

7、充血和壞死。B組小鼠在實驗的第6d，食欲和精神稍差，毛發(fā)沒有光澤，呼吸、活動正常。解剖小鼠見腹腔內(nèi)部臟器部分充血和水腫;實驗第9d，解剖小鼠見腹腔內(nèi)臟器充血、水腫、壞死、沒有白色膿點形成;實驗第20d，解剖小鼠見脾臟明顯腫大，肝臟略充血，腎臟稍水腫。C組小鼠飲食和精神佳，毛發(fā)光澤、無雜亂，呼吸、活動好，于實驗第6d、9d、20d解剖小鼠，腹腔內(nèi)部臟器都表現(xiàn)正常。
　　 2.播散性念珠菌感染小鼠腎臟組織真菌的培養(yǎng)和鑒定
　　

8、 將A組小鼠第6d、9d、20d的腎臟組織接種于沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)72h后，可見白色菌落生長，通過血清培養(yǎng)法和厚膜孢子瓊脂培養(yǎng)基鑒定為白念珠菌。
　　 3.組織病理學觀察
　　 A組小鼠，實驗第6d，鏡下可見完整腎小管、腎小球結構，PAS染色未見紫紅色孢子、菌絲;實驗第9d，鏡下可見腎小管、腎小球結構破壞，細胞核固縮，PAS染色見紫紅色孢子、菌絲;實驗第20d，腎小管、腎小球結構消失，壞死形成，PAS染色見大量紫紅色孢子

9、、菌絲;B組小鼠，實驗第6d，9d及20d，腎小管、腎小球結構完整，部分細胞變性，胞漿均質紅染，細胞核完整;C組小鼠顯微鏡下均呈正常表現(xiàn)。
　　 4.TLR4在蛋白水平表達情況
　　 運用免疫組織化學方法檢測小鼠腎臟中的TLR4主要在細胞胞膜中表達，陽性細胞可見胞膜上有棕黃色顆粒沉積。免疫組化染色結果顯示，A、B、C三組都顯示陽性細胞表達。A組:第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1935±0.2019、0.2183

10、±0.0369、0.1991±0.3083，表達呈先上升后下降趨勢，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。B組:第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1980±0.0290、0.2107±0.0240、0.2100±0.0288，表達呈先上升后下降趨勢，P＞0.05，差異沒有統(tǒng)計學意義。C組:第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1834±0.0182、0.2017±0.0258、0.1962±0.0232，表達呈先上升后下降趨勢，P＜0

11、.05，差異有統(tǒng)計學意義。實驗第6d，A、B、C三組OD值分別為0.1935±0.2019、0.1980±0.0290、0.1834±0.0182，實驗組比空白對照組表達升高，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，實驗第9d，A、B、C三組OD值分別為0.2183±0.0369、0.2107±0.0240、0.2017±0.0258，實驗組比空白對照組表達升高，P＞0.05，差異沒有統(tǒng)計學意義，實驗第20d，A、B、C三組OD值分別為0.19

12、91±0.3083、0.2100±0.0288、0.1962±0.0232，實驗組比空白對照組表達升高，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。進行重復測量設計資料方差分析，其中各組在不同時間點之間存在差別，F(xiàn)=8.093，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，進行總體比較不同組間不存在差別F=3.595，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 5.HSP90在蛋白水平中表達情況
　　 運用免疫組織化學方法檢測小鼠腎臟中HSP90主要

13、表達于細胞胞漿中，陽性細胞可見胞漿上有棕黃色顆粒沉積;免疫組化結果顯示，A、B、C三組都顯示陽性細胞表達。A組:實驗第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1851±0.0201、0.2155±0.0345、0.1894±0.0266，表達先上升后下降趨勢，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義;B組:實驗第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1769±0.0183、0.1961±0.0234、0.1924±0.0310，表達先上升后下降趨勢

14、，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義;C組:實驗第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1825±0.0300、0.1945±0.0345、0.1925±0.0351，表達先上升后下降趨勢，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。實驗第6d，A、B、C組OD值分別為0.1851±0.0201、0.1769±0.0183、0.1825±0.0300，實驗組比空白對照組表達升高，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，實驗第9d，A、B、C三組OD值分別為0.

15、2155±0.0345、0.1961±0.0234、0.1945±0.0345，實驗組比空白對照組表達升高，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，實驗第20d，A、B、C三組OD值分別為0.1925±0.0351、0.1924±0.0310、0.1894±0.0266,實驗組比空白對照組表達升高，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。通過重復測量資料設計方差分析，各組在不同時間點之間存在差別，F(xiàn)=8.375，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。進行總體

16、比較不同組間不存在差別，F(xiàn)=0.914，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 6.TLR4與HSP90的相關性結果
　　 實驗組HLR4與HSP90表達的OD值通過曲線擬合，實驗第6d得到r=0.002，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，說明二者無明顯相關;實驗第9d得到，r=0.000，P＞0.05，說明二者無明顯相關;實驗第20d得到，r=0.081，P＞0.05，說明二者無明顯相關。
　　 結論:
　

17、　 1.TLR4在播散性念珠菌病小鼠腎臟組織中的表達，在感染早期呈現(xiàn)上升趨勢，到晚期呈現(xiàn)下降趨勢。
　　 2.HSP90在播散性念珠菌病小鼠腎臟組織中的表達，在感染早期呈現(xiàn)上升趨勢，到晚期呈現(xiàn)下降趨勢。
　　 3.TLR4與HSP90的表達在感染晚期都呈現(xiàn)下降趨勢，有可能是造成白念珠菌侵襲性感染腎臟的病因之一。
　　 4.TLR4和HSP90在播散性念珠菌病小鼠腎臟組織的表達比在正常小鼠腎臟表達升高。