新型抗膽堿藥R2HBJJ抑制肺癌細(xì)胞增殖作用及機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是目前世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率逐年上升。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌患者的80％以上。盡管外科手術(shù)與放療化療的聯(lián)合應(yīng)用日臻完善,對(duì)肺癌的療效不斷提高,但其5年生存率仍低于20%。因此迫切需要發(fā)展新的治療方法。目前研究表明,肺癌細(xì)胞能夠合成和分泌乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)作為一種生長(zhǎng)因子,構(gòu)建自分泌促增殖網(wǎng)絡(luò),參與并促進(jìn)肺癌的發(fā)展進(jìn)程。

2、毒蕈堿型膽堿能受體(muscarinic cholinergic receptor,M受體)的M3亞型與煙堿型膽堿能受體(nicotinic cholinergic receptor,N受體)的α7亞型的選擇性拮抗劑,均能抑制肺癌細(xì)胞中過(guò)度激活的膽堿能信號(hào),從而抑制肺癌細(xì)胞增殖,為肺癌的預(yù)防和治療提供了新的藥物研發(fā)策略。R2HBJJ是由抗膽堿藥鹽酸戊乙奎醚衍生得到的季銨鹽,本研究的目的是考查R2HBJJ的抗膽堿特性,評(píng)價(jià)其對(duì)非小細(xì)胞肺癌

3、細(xì)胞增殖的影響,并探討可能的作用機(jī)制以及用于NSCLC治療的潛在可能性。結(jié)果如下:
　　1.放射性配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明,R2HBJJ能競(jìng)爭(zhēng)性抑制[3H]-NMS與M受體結(jié)合,抑制作用隨藥物濃度增加而增強(qiáng),對(duì)M1-5受體的競(jìng)爭(zhēng)抑制平衡解離常數(shù)Ki值依次為7.86±3.39×10-11、1.33±0.52×10-9、6.79±3.71×10-11、1.06±0.12×10-10和2.64±0.98×10-10M(n=3,F=121.2

4、,P<0.01),R2HBJJ對(duì)M3和M1受體顯示出較高的親和力。R2HBJJ抑制卡巴膽堿所誘發(fā)豚鼠支氣管平滑肌收縮的IC50為7.58±1.05×10-9M(n=5)。
　　2.采用全細(xì)胞膜片鉗記錄ACh誘發(fā)的大鼠背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元電流,R2HBJJ能濃度依賴性阻斷該電流,1μM、10μM、20μMR2HBJJ對(duì)電流的阻斷率分別為29.31±5.76%、91.35±1.03%、9

5、9.07±0.14%(n=3或5)。利用爪蟾卵母細(xì)胞分別表達(dá)大鼠α7和α9/α10受體,使用雙電極電壓鉗技術(shù)記錄ACh誘發(fā)的電流。100μMR2HBJJ能完全阻斷100μMACh誘發(fā)的α7受體電流(n=3),200μMR2HBJJ對(duì)200μMACh誘發(fā)的α9/α10受體電流的阻斷率為76.74±6.17%(n=4)。提示R2HBJJ具有阻斷DRG神經(jīng)元N受體以及在爪蟾卵母細(xì)胞上表達(dá)的大鼠α7受體和α9/α10受體亞型的作用。
　　

6、3.用磺酰羅丹明B(sulforhodamine B,SRB)法測(cè)定了R2HBJJ作用后細(xì)胞活力變化。R2HBJJ在體外能濃度依賴性地抑制NSCLC細(xì)胞H1299、H460和H157生長(zhǎng),作用72h后半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度GI50依次為8.5±0.15、8.8±0.42、28.5±0.75μM(n=6),但對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。R2HBJJ在10-40μM明顯抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度范圍內(nèi),不抑制正常人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D生長(zhǎng)。

7、對(duì)其它17種不同組織類型的腫瘤細(xì)胞研究顯示,不同的細(xì)胞對(duì)R2HBJJ具有不同的敏感性。
　　4.ACh能濃度依賴性拮抗R2HBJJ對(duì)H1299細(xì)胞增殖的抑制作用。以正常細(xì)胞為對(duì)照,分別伴隨給予0、0.3、1、3、10、30、100μMACh,細(xì)胞活力顯著增加,72h后R2HBJJ10μM組細(xì)胞活力分別為57.08±1.62%、65.61±4.52%、56.64±7.01%、74.92±5.42%、82.92±6.08%、88.76

8、±0.86%和91.41±3.99%(n=6);R2HBJJ20μM組細(xì)胞活力分別為19.67±2.15%、33.37±1.77%、24.53±1.76%、29.88±5.18%、35.72±4.26%、42.37±2.12%和58.17±4.38%(n=6)。
　　5.在H1299、H157、H460、A549和BEP2D細(xì)胞上應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)了膽堿能受體(Acetylcholinereceptors,AChRs)和膽堿

9、乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cholineacetyltransferase,ChAT)的表達(dá)。ChAT在這幾種細(xì)胞中均有表達(dá);M1-5、α7、α9、α10、β2和β4受體的表達(dá)有明顯差異,但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與對(duì)R2HBJJ敏感性特異相關(guān)的受體亞型表達(dá)。
　　6.以H1299細(xì)胞為模型,對(duì)比R2HBJJ和不同亞型選擇性AChRs拮抗劑對(duì)其增殖的抑制作用。M3受體選擇性拮抗劑達(dá)非那新的抑制作用與R2HBJJ相似,但弱于R2HBJJ。α7受體選擇性拮抗劑α

10、-Bungarotoxin(α-bgt)和N受體非選擇性拮抗劑美加明,在10μM內(nèi)對(duì)H1299生長(zhǎng)抑制作用均強(qiáng)于R2HBJJ。M1受體選擇性拮抗劑哌侖西平、M2/M4受體選擇性拮抗劑AF-DX116、M受體非選擇性拮抗劑阿托品、α4/β2和α4/β4受體選擇性拮抗劑DhβE抑制作用弱。提示R2HBJJ抑制H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的作用主要由M3受體和α7受體介導(dǎo),其它受體亞型可能同時(shí)參與該過(guò)程。
　　7.用流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytom

11、etry,FCM)考察了R2HBJJ對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。用20μMR2HBJJ處理H1299細(xì)胞24、48、72h,細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯變化,但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞周期G0/G1期比值由42.54±2.11%上升到76.21±2.75%,而S期則由46.78±1.40%下降到18.37±2.45%(n=3,P<0.01),表明R2HBJJ能時(shí)間依賴性誘導(dǎo)H1299細(xì)胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯。此外,R2HBJJ還能濃度依賴性誘導(dǎo)H1

12、299和H157細(xì)胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯。
　　8.使用WesternBlot方法,分析了調(diào)控細(xì)胞周期G1檢查點(diǎn)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵蛋白及其上游信號(hào)分子表達(dá)水平的變化。R2HBJJ可時(shí)間及濃度依賴性下調(diào)cyclinD1、CDK4、CDK6表達(dá),抑制Rb磷酸化,而對(duì)cyclinE和CDK2的表達(dá)影響小,這表明R2HBJJ誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯發(fā)生在G0/G1的早期。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明R2HBJJ可時(shí)間依賴性下調(diào)Thr308p-Akt、c-Myc

13、和Ser9p-GSK3β,提示R2HBJJ能在不同機(jī)制介導(dǎo)下使得PI3K/Akt通路激活受到抑制,從而導(dǎo)致Akt和它下游的c-Myc和GSK3β的磷酸化水平下調(diào),使得細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯于G0/G1期。此外,R2HBJJ還能經(jīng)由JNK通路抑制Tyr705p-Stat3核轉(zhuǎn)位,從而抑制參與G1期向S期轉(zhuǎn)化的下游信號(hào)分子轉(zhuǎn)錄。
　　本研究表明新型抗膽堿藥R2HBJJ對(duì)五種M受體亞型有不同的親和力

14、,但主要選擇拮抗M3和M1受體。R2HBJJ能阻斷ACh誘發(fā)的DRG神經(jīng)元電流以及在爪蟾卵母細(xì)胞上表達(dá)的α7受體和α9/α10受體電流。R2HBJJ通過(guò)拮抗M受體和N受體而抑制NSCLC細(xì)胞增殖,ACh能濃度依賴性阻斷R2HBJJ的抑制作用。R2HBJJ主要經(jīng)由PI3K/Akt通路下調(diào)細(xì)胞周期G1檢查點(diǎn)調(diào)控蛋白Ser807/811p-Rb、cyclinD1、CDK4和CDK6的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。此外,R2HBJJ還能經(jīng)