可溶性纖維介素在移植腎急性排斥中的作用及機制研究.pdf

1、目的:急性排斥反應(yīng)（acute rejection,AR）是腎移植術(shù)后的主要并發(fā)癥，影響移植腎及受者的長期存活。腎小管上皮細胞（tubular epithelial cells，TEC）凋亡是移植腎急排損傷的重要病理表現(xiàn)，但其具體機制尚不明確?？扇苄岳w維介素（soluble fibrinogen-like protein2，sFGL2）是調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory Tcells，Treg)分泌的效應(yīng)分子，可誘導(dǎo)細胞凋亡從而介導(dǎo)組

2、織損傷。本課題擬研究腎移植術(shù)后急排患者的血清sFGL2表達情況，分析其與外周血中促炎因子TNF-α、IFN-γ水平及Treg比例的關(guān)聯(lián)，體外探索TNF-α、IFN-γ對CD4+T細胞分泌sFGL2的刺激作用及相關(guān)信號通路，并進一步探究sFGL2對TEC凋亡的影響，擬揭示sFGL2在移植腎急排中的作用，完善Treg在急排中的生物學(xué)效應(yīng)，為進一步闡明移植腎急排的機制及臨床防治提供理論依據(jù)。
　　方法:收集40名于2010年11月至20

3、11年8月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受移植腎穿刺的同種異體腎移植受者資料，采集外周血，并根據(jù)臨床表現(xiàn)及移植腎穿刺病理證實結(jié)果分為急排組和移植腎功能穩(wěn)定組（每組20名）。其中急排組根據(jù)Banff07病理分級標準進一步分為急性細胞性排斥Ⅰ級組（8名），急性細胞性排斥Ⅱ級組（6名）和急性體液性排斥組（6名）。納入健康志愿者15名作為正常對照。利用ELISA檢測血清sFGL2及TNF-α、IFN-γ水平，采用流式細胞術(shù)檢測外周血CD4+ CD25

4、+ Foxp3+ Treg比例。從健康志愿者采集外周血，利用流式磁珠分選技術(shù)分離獲得CD4+T細胞并體外培養(yǎng)。用不同濃度的TNF-α(62.5、125、250、500、1000U/ml)、IFN-γ(62.5、125、250、500、1000U/ml)或PBS分別刺激CD4+T細胞24、48和72小時，利用ELISA檢測培養(yǎng)液上清sFGL2濃度，Phosflow流式細胞術(shù)檢測CD4+T細胞內(nèi)MAPK信號通路蛋白磷酸化水平。根據(jù)上述結(jié)果，

5、用相關(guān)MAPK通路蛋白抑制劑干預(yù)CD4+T細胞，檢測處理后的細胞培養(yǎng)液上清sFGL2水平的變化。此外，用10μg/ml sFGL2、10 ng/ml TNF-α（陽性對照）或PBS（陰性對照）體外刺激人TEC48小時，通過AnnexinⅤ-FITC/PI染色，采用流式細胞術(shù)檢測TEC凋亡情況，并利用RT-qPCR檢測ⅡC凋亡相關(guān)基因表達情況。本研究通過復(fù)旦大學(xué)倫理委員會批準。
　　結(jié)果:移植腎急排患者外周血sFGL2水平顯著升高，

6、且與排斥嚴重程度及類型相關(guān):對比40例腎移植受者及15例健康志愿者血清sFGL2水平發(fā)現(xiàn)，病理證實急排的患者血清sFGL2水平（64.84±10.36 ng/ml，n=20）明顯高于移植腎功能穩(wěn)定的患者（37.82±3.56 ng/ml，n=20，p＜0.05）或健康志愿者（31.25±4.08 ng/ml，n=15，p＜0.05），而腎功能穩(wěn)定的患者與健康志愿者相比無顯著差異;病理證實體液性排斥反應(yīng)的患者血清sFGL2明顯高于細胞性排

7、斥反應(yīng)的患者（118.80±20.28 vs.41.71±4.39 ng/ml，p＜0.001）;在細胞性排斥反應(yīng)患者中，Banff分級Ⅱ級的患者血清sF GL2明顯高于Ⅰ級的患者（51.87±7.81 vs.34.10±3.27 ng/ml，p＜0.05）。此外，移植腎急排患者外周血促炎因子TNF-α(114.90±10.20 vs.67.21±8.27 pg/ml,p＜0.001)、IFN-γ(257.69±28.60 vs.88.

8、15±10.85 pg/ml，p＜0.001)水平與Treg比例（4.05±0.08 vs.2.39±0.06％，p＜0.001）均較腎功能穩(wěn)定患者顯著升高，且與sFGL2呈正相關(guān)（Spearman相關(guān)系數(shù)r分別為0.962、0.863和0.739，所有p＜0.001）。在體外研究中，通過不同濃度的TNF-α、IFN-γ和PBS分別刺激CD4+T細胞，發(fā)現(xiàn)在1000U/mlTNF-α(0.947±0.102 ng/ml)或62.5U/m

9、l IFN-γ(0.947±0.091ng/ml)刺激48小時的條件下，CD4+T細胞分泌的sFGL2最多。此外，1000U/mlTNF-α(429.33±54.49,p＜0.05)或62.5U/ml IFN-γ(520.33±36.57，p＜0.01)較PBS（131.67±45.58）刺激時，CD4+T細胞中磷酸化JNK均顯著增高;而p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化水平均無顯著性差異。進一步研究顯示，經(jīng)過JNK抑制劑處理的CD

10、4+T細胞JNK磷酸化水平明顯減少（TNF-α、IFN-γ、 PBS刺激分別為:280.67±0.67vs.399.67±0.33，p＜0.001;350.33±0.88vs.517.33±0.33, p＜0.001;95.33±1.33 vs.138.33±0.67，p＜0.001)，而培養(yǎng)液上清中sFGL2水平顯著降低(TNF-α、IFN-γ、 PBS刺激分別為:0.550±0.081 vs.0.977±0.108 ng/ml，p＜

11、0.05;0.548±0.105 vs.1.010±0.127 ng/ml,p＜0.05;0.278±0.050 vs.0.514±0.054 ng/ml,p＜0.05）。此外，采用sFGL2體外刺激，可較PBS更顯著誘導(dǎo)TEC凋亡（33.13±0.10 vs.12.91±0.35％，p＜0.001），不僅誘導(dǎo)早期凋亡(10.19±0.13 vs.4.05±0.07％，p＜0.001)，亦誘導(dǎo)晚期凋亡（22.82±0.41 vs.9.4

12、4±0.06％，p＜0.001）。sFGL2誘導(dǎo)TEC的早期凋亡比例明顯高于TNF-α（9.74±0.07％，p＜0.05），而晚期凋亡比例和總凋亡比例則明顯低于TNF-α（30.63±0.52％，40.34±0.24％，二者均p＜0.001）。與PBS相比，sFGL2刺激后TEC中Caspase、TNF、Bcl-2、NFKB等凋亡相關(guān)家族中促凋亡基因如CASP-3(p＜0.05)、CASP-8(p＜0.05)、CASP-9(p＜0.0

13、5)、CASP-10(p＜0.05)、TRADD(p＜0.001)、TNFSF10(p＜0.01)、FADD(p＜0.001)、FAS(p＜0.001)、FASLG(p＜0.05)、BAK1(p＜0.05)、BAD(p＜0.05)、BAX(p＜0.001)和NF-KB1(p＜0.01)均顯著上調(diào)，而抑凋亡基因如CARD-18、NAIP、BCL2、IKBKB和TBK1的表達則無明顯變化。
　　結(jié)論:移植腎急排患者外周血sFGL2水平