熱休克蛋白90在肝硬化門靜脈高壓癥內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)中的作用.pdf

1、我國是病毒性肝炎的高發(fā)地區(qū)，而乙型病毒性肝炎慢性化引起肝硬化，并最終導(dǎo)致門靜脈高壓癥（portal hypertension，PHT）的患者人群數(shù)量龐大。肝硬化門靜脈高壓癥是嚴(yán)重威脅人類健康的一種臨床綜合征，其內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)相關(guān)的并發(fā)癥是臨床上常見而且棘手的難題，其中以食管胃底靜脈曲張破裂導(dǎo)致大出血最為嚴(yán)重，是導(dǎo)致PHT患者死亡的重要原因之一，也是臨床上治療的重點(diǎn)。因此，闡明PHT發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制，以期尋求合適的治療策略，防治食管

2、胃底靜脈曲張破裂出血，改善PHT患者的生活質(zhì)量，降低死亡率，仍然具有重要的社會(huì)意義。肝硬化門靜脈高壓癥以肝內(nèi)血流阻力增加和內(nèi)臟及全身高血流動(dòng)力循環(huán)為主要發(fā)病機(jī)制，其中前者被認(rèn)為是PHT發(fā)生的起始因素，而后者在PHT的維持和發(fā)展過程中具有不可替代的作用。
　　目前研究已經(jīng)證實(shí)，肝硬化導(dǎo)致PHT發(fā)生之后，內(nèi)臟血管是擴(kuò)張的，而血液循環(huán)中縮血管物質(zhì)如去甲腎上腺素（nore pinephrine，NE）等濃度卻增加，即表現(xiàn)為內(nèi)臟動(dòng)脈對(duì)縮血管

3、物質(zhì)低反應(yīng)性。而大量研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，肝硬化 PHT患者及動(dòng)物模型循環(huán)血中擴(kuò)血管物質(zhì)的含量也是增加的，如一氧化碳（carbon monoxide，CO）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2)等，其中NO的過度生成被認(rèn)為在肝硬化PHT發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。而過度生成的NO被認(rèn)為主要是由于內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNO

4、S）的表達(dá)增加和活性增強(qiáng)所致。熱休克蛋白90（heat shock protein90，HSP90）是熱休克蛋白的一種，既往研究表明其在eNOS的表達(dá)和活化過程中都具有不可替代的作用，而也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在PHT中的表達(dá)是升高的，但HSP90是否參與了肝硬化PHT的內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)，以及其中的具體機(jī)制，并未闡明。
　　本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)肝硬化PHT大鼠門靜脈血流動(dòng)力學(xué)變化，腸系膜微血管對(duì)NE的反應(yīng)性變化，循環(huán)血和腸系

5、膜動(dòng)脈內(nèi)NO含量以及腸系膜動(dòng)脈內(nèi)HSP90、eNOS和p-eNOS的蛋白表達(dá)變化，并通過比較HSP90特異性抑制劑格爾德霉素（geldanamycin，GA）干預(yù)前后上述指標(biāo)的變化來探究HSP90在CCl4誘導(dǎo)肝硬化PHT內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)中的作用及可能的機(jī)制。
　　第一部分：四氯化碳致肝硬化門靜脈高壓癥大鼠模型的制備及微血管灌流孵育系統(tǒng)的建立
　　目的：探究CCL4背部皮下注射制備肝硬化門靜脈高壓癥大鼠模型的可行性以及獲取腸系

6、膜微動(dòng)脈后體外嗎啉丙磺酸(morpholinopropanesulfonic acid，MOPS)緩沖液中測(cè)定其活性。方法：雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（normal group，N組）和肝硬化門靜脈高壓癥組（PHT組），PHT組以60％的CCL4油溶液按照0.5ml/100g大鼠體重為標(biāo)準(zhǔn)背部皮下注射，每周2次，共16周，期間間斷予5%乙醇飲用；N組以同樣的方式和劑量予生理鹽水背部皮下注射。造模結(jié)束后B超檢測(cè)兩組大鼠的門靜脈血流動(dòng)力

7、學(xué)指標(biāo)，多功能監(jiān)測(cè)儀測(cè)定門靜脈壓力（portal vein pressure，PP）；解剖顯微鏡下取腸系膜三級(jí)動(dòng)脈，置于MOPS緩沖液中，調(diào)整管腔內(nèi)壓力為80mmHg，構(gòu)建微血管灌流孵育系統(tǒng)，平衡后予NE和乙酰膽堿（Acetylcholine，Ach）刺激血管，測(cè)量血管直徑的變化。結(jié)果：①PHT組大鼠有消瘦，煩躁，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象，肝臟可見明顯肝硬化結(jié)節(jié)，腹腔內(nèi)有腹水，模型制備成功；②PHT組門靜脈血流速度（portal vei

8、n blood flow velocity，PBV）和門靜脈血流量（portal vein blood flow，PBF）明顯低于N組{（2.2857±0.15736）cm/s vs（3.0571±0.16183）cm/s(p<0.01)；（1.7143±0.14875） ml/min vs（2.5714±0.15345）ml/min(p<0.01)}，門靜脈直徑（portal vein diameter，PVD）在 PHT組與N組之間

9、無明顯差異{（1.4012±0.08165） mm vs（1.3886±0.13801）mm(p>0.05)}，PHT組PP水平明顯高于N組{（14.40±0.88） mmHg vs（7.53±0.58）mmHg(p<0.01)}；③兩組大鼠腸系膜微動(dòng)脈在構(gòu)建好血管灌流孵育系統(tǒng)之后，平衡1-2小時(shí)均出現(xiàn)自主收縮，加入NE出現(xiàn)血管進(jìn)一步地收縮，而加入Ach則出現(xiàn)血管擴(kuò)張現(xiàn)象。結(jié)論：CCL4背部皮下注射并間斷飲用乙醇可成功制備肝硬化PHT大

10、鼠模型，體外孵育的腸系膜三級(jí)微動(dòng)脈在MOPS緩沖液中存在活性。
　　第二部分：肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素的反應(yīng)性以及腸系膜動(dòng)脈內(nèi)HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白含量的測(cè)定
　　目的：檢測(cè)PHT組大鼠和N組大鼠腸系膜微動(dòng)脈對(duì)去甲腎上腺素的反應(yīng)性差異、血清和腸系膜動(dòng)脈內(nèi)NO的含量變化以及腸系膜動(dòng)脈內(nèi)HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白表達(dá)的變化。方法：建立腸系膜三級(jí)動(dòng)脈的血管灌流孵育系統(tǒng)，測(cè)定其在不同NE

11、濃度下的血管內(nèi)徑變化；取大鼠循環(huán)血及腸系膜動(dòng)脈，測(cè)定其NO的含量；取腸系膜動(dòng)脈，免疫印跡分析法檢測(cè)其中HSP90、eNOS和p-eNOS的蛋白表達(dá)。結(jié)果：①PHT組腸系膜三級(jí)動(dòng)脈的NE量-效曲線較N組明顯右移，EC50值明顯增大；②肝硬化PHT大鼠血清NO水平為（75.4±9.9）μmol/L，明顯高于對(duì)照組大鼠血清NO水平（47.3±8.6）μmol/L（P<0.01）。③肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈NO含量為（367.8±54.2）μ

12、mol/gprot，明顯高于對(duì)照組大鼠NO含量（209.3±45.6）μmol/gprot（P<0.01）；④PHT組大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白表達(dá)均較N組明顯上調(diào)。結(jié)論：PHT組大鼠腸系膜三級(jí)動(dòng)脈對(duì)NE的收縮反應(yīng)性較N組明顯降低，呈現(xiàn)低反應(yīng)性，血清和腸系膜動(dòng)脈內(nèi)NO水平明顯升高，同時(shí)伴有HSP90、eNOS和p-eNOS的表達(dá)上調(diào)。
　　第三部分：格爾德霉素對(duì)肝硬化PHT大鼠門靜脈血流動(dòng)力學(xué)、腸系膜微

13、動(dòng)脈對(duì)NE的反應(yīng)性以及腸系膜動(dòng)脈內(nèi)HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白表達(dá)的影響
　　目的：研究HSP90在肝硬化PHT內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)形成中的作用及可能的機(jī)制。方法：在模型制備至16周完成之后，將每組的剩余大鼠隨機(jī)分為兩個(gè)亞組，PHT+GA組和N+GA組，將溶解于二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中的GA以1mg/Kg大鼠體重為標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射，每天1次，共1周；PHT+DMSO組和N+DMSO組，同樣的方式

14、和劑量予DMSO腹腔注射，每天1次，共1周。然后測(cè)定各組大鼠的門靜脈血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、門靜脈壓力、腸系膜微動(dòng)脈對(duì)NE的反應(yīng)性、血清和腸系膜動(dòng)脈內(nèi)NO含量及腸系膜動(dòng)脈內(nèi)HSP90、eNOS和p-eNOS蛋白表達(dá)。結(jié)果：①PHT+GA組與PHT+DMSO組大鼠的PBV、PBF、PBD和PP值分別為{（2.3458±0.15235） cm/s vs（2.4005±0.12436） cm/s(p>0.05)，（1.6714±0.14015）ml/

15、min vs（1.7136±0.09412）ml/min(p>0.05)，(1.3652±0.08235） mm vs（1.3586±0.12803）mm(p>0.05)，（15.04±0.74）mmHg vs（14.43±0.63） mmHg(p>0.05)}，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②N+GA組與N+DMSO組大鼠的PBV、PBF、PBD和PP值分別為{（3.1013±0.11275） cm/s vs（3.0571±0.09435）cm

16、/s(p>0.05)，（2.4682±0.08641） ml/min vs（2.5427±0.11443） ml/min(p>0.05)，（1.3456±0.11254）mm vs（1.3686±0.09541）mm(p>0.05)，（7.57±0.86）mmHg vs（7.34±0.46）mmHg(p>0.05)}，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③在PHT大鼠中，GA干預(yù)之后大鼠腸系膜三級(jí)動(dòng)脈對(duì)NE的量-效曲線部分左移，EC50明顯降低，差異有

17、明顯統(tǒng)計(jì)意義；④在N組大鼠之中，GA干預(yù)之后大鼠腸系膜三級(jí)動(dòng)脈對(duì)NE的量-效曲線移動(dòng)不明顯，EC50無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；⑤在PHT組大鼠中，GA可使血清和腸系膜動(dòng)脈內(nèi)NO含量均顯著降低{(62.4±8.6)μmol/L vs(78.1±11.2)μmol/L(p<0.01)，(295.8±45.7)μmol/gprot vs(369.3±54.2)μmol/gprot(p<0.01)}；⑥在N組大鼠之中，GA干預(yù)前后，血清和腸

18、系膜動(dòng)脈內(nèi)NO水平分別為{(46.4±6.9)μmol/L vs(47.1±6.2)μmol/L(p>0.05)，(214.8±44.1)μmol/gprot vs(209.3±34.2)μmol/gprot(p>0.05)},差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；⑦PHT組中，GA干預(yù)可使腸系膜動(dòng)脈HSP90、eNOS和p-eNOS的蛋白表達(dá)下調(diào)；⑧N組中，GA干預(yù)未能使腸系膜動(dòng)脈HSP90、eNOS和p-eNOS的蛋白表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：肝硬化PHT中過度