Spl對Ki-67基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響.pdf

1、目的:研究Ki-67核心啟動子區(qū)域存在的Spl順式作用元件對Ki-67基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。
　　 方法:以Ki-67啟動子質(zhì)粒pGLBK235(-223～+12)為模板,針對其核心調(diào)控序列的Spl一致性序列(CCCGCC)采取定點突變(CCCGCC→CCTGCC)的方法獲取重組突變體。分別轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞(Hela)、人腎癌細胞(OS-RC-2)、人肺癌細胞(A549),使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測啟動子活性的變化。分別用

2、Spl真核表達載體pN3-Spl、Spl小干擾Spl SiRNA以及與GC富含序列選擇性結(jié)合的抗腫瘤藥物光神霉素作用于上述細胞,用細胞免疫組化檢測Ki-67蛋白的變化,用RT-PCR檢測Ki-67mRNA的變化,用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測質(zhì)粒pGLBK235啟動子轉(zhuǎn)錄活性的變化。
　　 結(jié)果:對質(zhì)粒pGLBK235(-223～+12)進行定點突變后得到的兩個重組突變體的啟動子活性在三種腫瘤細胞中均有不同程度的降低,其中突變

3、體二(MutB)的啟動子活性下降幅度較大,其在Hela、OS-RC-2、A549三種腫瘤細胞中的啟動子活性分別降至突變前片段BK235的36.9％、26.9％、28.6％。pN3-Spl轉(zhuǎn)染細胞其Ki-67蛋白與mRNA的量均有增多,與pN3-Spl共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒pGLBK235啟動子活性也有不同程度的升高,在Hela、OS-RC-2、A549三種腫瘤細胞中的啟動子活性分別為未行共轉(zhuǎn)染的BK235的1.68倍、1.34倍、1.83倍。Sp

4、l siRNA以及光神霉素作用過的細胞其Ki-67蛋白與mRNA的量均有減少,質(zhì)粒pGLBK235啟動子活性也有不同程度的降低。其中與Spl siRNA共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒pGLBK235啟動子活性在Hela、OS-RC-2、A549三種腫瘤細胞中分別降至未行共轉(zhuǎn)染的BK235的45.9％、64.5％、46.O％;受到光神霉素作用的質(zhì)粒pGLBK235的啟動子活性則隨著藥物濃度的升高呈階梯性降低,其中藥物濃度為500nM時其活性最低,在Hela

5、、OS-RC-2、A549細胞分別降至未受藥物作用的BK235的34.7％、44.2％、29.8％。
　　 結(jié)論：Ki-67核心調(diào)控序列(-170～-144)中兩個Spl一致性序列(CCCGCC)能夠影響Ki-67基因的啟動子活性,對其進行定點突變可使啟動子活性降低。Spl真核表達質(zhì)粒pN3-Spl可以通過增加Spl蛋白的表達來增強Ki-67基因的啟動子活性。Spl小干擾Spl-siRNA和抗腫瘤藥物光神霉素可分別通過減少或抑制