實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎大鼠穹窿下器的形態(tài)學(xué)觀察.pdf

1、本文對大鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)不同時(shí)期的穹窿下器(SFO)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，探討該室周器官在EAE發(fā)病過程中的作用。 研究方法：選擇健康雌性Wistar大鼠90只，體重180-220g，隨機(jī)分為5組：①對照組(n=18)：不做任何處理；②EAE6h組(n=18)：為柔膜反應(yīng)組；③EAE7天組(n=18)：為潛伏期組；④EAE14天組(n=18)：為發(fā)病極期組；⑤EAE21天組(n=18)：為恢復(fù)期組。 1.E

2、AE模型制備：用豚鼠脊髓勻漿加完全福氏佐劑，主動免疫Wistar雌性大鼠，在免疫后6小時(shí)，7天，14天，21天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，常規(guī)經(jīng)心灌注、固定，取腦。分別以HE染色、掃描電鏡、透射電鏡、TUNEL組化染色，觀察穹窿下器的形態(tài)學(xué)變化。 2.光鏡標(biāo)本制備：常規(guī)經(jīng)心灌注，取腦，冠狀方向去除視交叉以前和漏斗柄以后部分，取中間腦塊，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)石蠟切片，片厚5μm。常規(guī)HE染色，封片。顯微鏡觀察、照相。 3.電鏡樣品制備：麻醉

3、、灌注同光鏡標(biāo)本制備，但灌注液為1.5％的多聚甲醛和2.5％戊二醛磷酸緩沖液。在距離腦底面3mm處做一水平切口，將腦塊分為背、腹兩半，在背側(cè)半的腹側(cè)面觀察到室間孔后，在室間孔前2mm、后3mm處各做一道冠狀切口，將腹側(cè)間腦結(jié)構(gòu)掰掉，所暴露的凹弧面為第三腦室頂面，其正中的小丘狀突起為SFO。PBS沖洗，梯度酒精脫水，叔丁醇置換，二氧化碳臨界點(diǎn)干燥，真空噴金，日立S-520N觀察、照相。透射電鏡樣品制備與掃描電鏡樣品制備相同，取下SFO，放

4、入4％戊二醛中保存，1％鋨酸后固定，Epon812包埋，切片，T-3500N透射電鏡觀察、照相。 4.標(biāo)示凋亡細(xì)胞：石蠟切片，片厚4μm，常規(guī)脫蠟至水，蛋白酶K消化，0.3％H2O2甲醇液封閉，冰上透化后加TUNEL反應(yīng)液，POD轉(zhuǎn)染，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，脫水、透明，封片。顯微鏡觀察、照相。 研究結(jié)果： 1.光鏡觀察結(jié)果：對照組SFO室管膜細(xì)胞表面光滑，室管膜細(xì)胞單層排列，未見淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞，凋亡細(xì)胞少見(5

5、.33±2.52)。柔膜反應(yīng)期組可見凋亡細(xì)胞增多(13.67±2.31)，室管膜細(xì)胞出現(xiàn)復(fù)層；潛伏期組的穹窿下器凋亡細(xì)胞比前期增多(19.33±2.08)，可見核深染的小圓形淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞增多；發(fā)病極期組，細(xì)胞腫脹，血管擴(kuò)張，血管周圍存在大量淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞，呈現(xiàn)典型的“套袖樣”改變，SFO凋亡細(xì)胞數(shù)量最多(24.67±6.79)，主要分布于血管周圍；恢復(fù)期組血管“套袖樣”病變開始恢復(fù)，細(xì)胞浸潤減輕，病灶數(shù)量減少，凋亡細(xì)胞數(shù)量較發(fā)病極期減

6、少(9.33±1.76)。TUNEL陽性細(xì)胞在EAE后6h組增加，與對照組比較差異顯著(P＜0.05)，14天達(dá)高峰。發(fā)病極期及7天組與對照組比較有顯著差異(P＜0.01)；恢復(fù)期與對照組比較無顯著差異性(P＞0.05)。 2.掃描電鏡觀察結(jié)果： 2.1.正常對照組：SFO表面纖毛稀少，與周圍腦室界限清楚，室管膜細(xì)胞界限清晰，呈鵝卵石狀隆起排列，形狀規(guī)則，直徑4μm-10μm不等，突向腦室腔。室管膜細(xì)胞表面可見密集的微絨

7、毛，(長度0.5μm左右)或乳頭狀微突起(長度0.2μm左右)，在SFO表面，室管膜上可見豐富的纖維網(wǎng)及少數(shù)神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu)，主要分布在嘴側(cè)區(qū)和過渡區(qū)，神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu)的胞體直徑有4.5μm，突起細(xì)長，末端伸入室管膜細(xì)胞之間。 2.2.EAE組：在EAE潛伏期，室管膜細(xì)胞極度隆突，表面可見分泌物，纖毛和微絨毛減少，室管膜上可見巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞和淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞附著。在EAE發(fā)病期可見SFO室管膜細(xì)胞表面有火山口樣結(jié)構(gòu)，直徑l-3μm，細(xì)胞內(nèi)

8、有殘余的齒輪狀胞核結(jié)構(gòu)；凡有此結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，胞體平坦不再向腦室隆突，其體積均較正常小，細(xì)胞形態(tài)不再規(guī)則，細(xì)胞間界限不清。室管膜表面的微絨毛、微突起變化不大，有的室管膜表面細(xì)胞可見到小破孔，纖維網(wǎng)豐富，隨臨床癥狀的緩解，SFO室管膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常。 3.透射電鏡觀察結(jié)果： 3.1.正常對照組：穹窿下器具有典型的窗性毛細(xì)血管，其內(nèi)皮細(xì)胞間缺乏緊密連接，具有薄隔開窗和內(nèi)皮裂隙。毛細(xì)血管基膜薄而不連續(xù)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足未完

9、整包繞毛細(xì)血管。SFO室管膜細(xì)胞腦室面完整，可見微絨毛和微突起，核染色質(zhì)清晰可見。髓鞘呈典型的“板層樣”結(jié)構(gòu)，排列有序。SFO室管膜細(xì)胞表面可見到直徑約180-200nm圓形或橢圓形的分泌空泡。 3.2.EAE組：潛伏期，室管膜細(xì)胞之間連接出現(xiàn)鋸齒狀擴(kuò)大區(qū)，局部可達(dá)3.2μm。室管膜下組織與血管之間由完整的隔膜隔開，SFO的血管擴(kuò)張，血管周圍極度水腫，血管周分布有形狀不一的多泡體和囊泡；發(fā)病極期，SFO室管膜細(xì)胞連接緊密，細(xì)胞之

10、間的擴(kuò)大區(qū)少見，室管膜面可見較多分泌顆粒和叢密的微絨毛。SFO結(jié)構(gòu)水腫程度最高，室管膜下可見較多的水腫泡，血管周圍水腫相對減輕；可見髓鞘崩解現(xiàn)象，血管周圍膠質(zhì)細(xì)胞形成的板層樣結(jié)構(gòu)層數(shù)和指狀突起增多。恢復(fù)期，SFO室管膜細(xì)胞表面光滑，室管膜下水腫減輕，室管膜細(xì)胞間連接緊密，無擴(kuò)張現(xiàn)象，SFO水腫減輕，呈彌散樣。 研究結(jié)論： 1.本研究首次發(fā)現(xiàn)SFO室管膜下組織與血管之間由完整的隔膜分開，使其分處于不同的環(huán)境中。 2