骨髓間充質干細胞-透明質酸復合物對放射性潰瘍創(chuàng)面愈合的影響.pdf

1、目的：探討骨髓間充質干細胞—透明質酸復合物對大鼠放射性潰瘍創(chuàng)面的影響及其可能的作用機制。 方法：①分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質干細胞（MSCs），采用流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD29，CD31，CD44，CD45，以明確分離培養(yǎng)的細胞為MSCs。通過體外誘導使其分化為脂肪細胞，采用油紅0染色鑒定分化的脂肪細胞，證實MSCs的多向分化潛能。②將透明質酸與MSCs聯合培養(yǎng)，通過觀察細胞懸液在生物載體上的擴散程度來判斷透明質酸載體親

2、水性大小，通過觀察細胞懸液在生物載體上是否飄動來判斷透明質酸載體對細胞粘附力，并檢測MSCs的細胞表面標志、細胞周期及分化為脂肪細胞的潛能。③采用Sr—90皮膚敷貼器，以45Gy劑量體外照射SD大鼠臀部兩側皮膚，造成放射性皮膚潰瘍動物模型，觀察大鼠皮膚創(chuàng)面炎癥反應，檢測創(chuàng)面組織羥脯氨酸含量，判斷愈合情況。④將MSCs—透明質酸復合物移植入皮膚創(chuàng)面，比較MSCs—透明質酸復合物組、透明質酸組、空白對照組的創(chuàng)面愈合率，HE染色進行組織學觀察

3、，Ⅷ因子免疫組化進行微血管計數，檢測創(chuàng)面組織羥脯氨酸含量判斷愈合質量。熒光顯微鏡下觀察CM—DiI標記MSCs，以檢測MSCs的遷移分布。 結果：⑴采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞，細胞接種于培養(yǎng)瓶后，原代細胞經過24h后可見大量細胞貼壁生長，48～72h后開始伸展，6～8d后貼壁細胞數目明顯增多，細胞生長進入指數生長期。傳代細胞生長至第3代后，細胞形態(tài)漸趨一致。經流式細胞儀檢測，骨髓間充質干細胞表面特異抗

4、原CD29和CD44呈高表達，不表達CD31和CD45。骨髓間充質干細胞經成脂誘導后，油紅0染色陽性，保持了成脂分化的潛能。⑵透明質酸與骨髓間充質干細胞共同培養(yǎng)顯示，透明質酸具有較強的親水性，對骨髓間充質干細胞的吸附力強。經流式細胞儀檢測，MSCs—透明質酸復合物細胞表面標志物與骨髓間充質干細胞一致。MSCs—透明質酸復合物保持了成脂分化的潛能。細胞周期分析顯示，MSCs—透明質酸復合物G1+G2期細胞為94.2％，骨髓間充質干細胞G1

5、+G2期細胞為95.5％，提示均為低分化細胞，符合干細胞特性。⑶采用Sr—90皮膚敷貼器體外照射大鼠皮膚45min，劑量為45Gy，可導致大鼠放射性皮膚潰瘍。照射2～3周后，局部皮膚出現潰瘍。照射后5周潰瘍不再增大。照射后6～9周，潰瘍周圍可見新生上皮長入，傷口收縮遲緩。創(chuàng)面羥脯氨酸含量較正常對照皮膚顯著降低。⑷MSCs—透明質酸復合物移植到創(chuàng)面后，熒光顯微鏡下可見CM—DiI標記的MSCs。MSCs—透明質酸復合物組創(chuàng)面愈合率、羥脯氨

6、酸含量顯著高于透明質酸組和對照組，Ⅷ因子免疫組化陽性細胞增多，微血管計數顯著高于透明質酸組和對照組，組織學觀察顯示，MSCs—透明質酸復合物移植術后2～3周，可見表皮新生。Masson染色可見膠原纖維平行于創(chuàng)面排列。 結論：①MSCs體外培養(yǎng)生長穩(wěn)定，傳代后仍保持未分化狀態(tài)，具有多分化潛能。②透明質酸與MSCs聯合培養(yǎng)，未改變MSCs的特性及體外分化能力，且透明質酸與MSCs組織相容性好，對MSCs無毒性作用。③采用Sr—90皮