三節(jié)指節(jié)拇指相關肢端畸形的致病基因研究.pdf

1、三節(jié)指節(jié)拇指一并多指綜合征(triphalangeal thumb polysyndactyly syndrome，TPTPS、MIM 190605)是一種呈常染色體顯性遺傳的肢端畸形，表現(xiàn)為在第1指即大拇指的位置出現(xiàn)一個或多個具有三節(jié)指節(jié)的類似大拇指結構，同時在第3，4和5指間存在并指，而第2指往往受累較輕。1994年，TPTPS和軸前多指/三節(jié)指節(jié)拇指(preaxial polydactyly/triphalangeal thumb

2、，PPD/TPT)兩種都表現(xiàn)三節(jié)指節(jié)拇指的肢端畸形的致病基因同時被定位于染色體7q36區(qū)域。進一步擴大家系進行的連鎖分析將PPD/TPT基因的關鍵區(qū)域縮小到450kb并排除了SHH基因。通過比較基因組和轉基因動物的定位分析實驗發(fā)現(xiàn)，此區(qū)域內(nèi)LMBR1(limbregion 1)/C7ORF2基因第5內(nèi)含子中存在大約800bp的極化活性區(qū)(zone ofpolarizing activity,ZPA)調(diào)控序列(ZPA regulatory

3、 sequence，ZRS)，在它控制下的LacZ報告基因在肢芽后緣ZPA區(qū)域有特異性表達。隨后，研究人員在Hx(hemimelic-extra toes)和M100081突變鼠以及4個人類PPD/TPT家系中發(fā)現(xiàn)了ZRS的點突變，證實了這個ZRS作為SHH順式增強因子在PPD/TPT中的致病作用。在TPTPS家系中進行的定位研究僅能確定致病基因位于包含PPD/TPT關鍵區(qū)域和SHH基因的染色體7q36區(qū)域，范圍較大。在TPTPS患者表

4、型中出現(xiàn)TPT、IV型(Haas型)并指和脛側半肢畸形．多并指．三指節(jié)拇指綜合征(fiNal hemimelia-polysyndactyly-triphalangeal thumb syndrome，THTPTTS，MIM 188770)共存的事實提示，TPT、TPTPS、Haas．型并指和THPTTS可能是同一種遺傳機制導致的不同表現(xiàn)形式。但迄今為止，TPTPS致病基因仍然未知。對TPTPS進行深入的分子遺傳學研究，將會有助于揭示T

5、PT相關肢端畸形的發(fā)生機制，為這種嚴重出牛缺陷的基因診斷和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。 本文收集了兩個中國人TPTPS家系，家系中受累個體具有典型的TPTPS手部畸形。根據(jù)文獻和UCSC人類基因組數(shù)據(jù)庫選擇遺傳標記進行連鎖分析和單倍型分析，首次在中國人家系中確認了TPTPS致病基因定位于染色體7q36。在家系1(18名家系成員，7名患者)中進行兩點連鎖分析，當θ=O時遺傳標記P384獲得最大Lod值為3．72，肯定連鎖。該家系中遺傳標記D

6、7S3037與其端粒側臨近標記之間發(fā)生一次重組事件，表明TPTPS致病突變位于SHH基因端粒側。家系2(8名家系成員，3名患者)中，患者共享染色體7q36區(qū)域遺傳標記的單體型，提示致病突變定位于同一染色體區(qū)域。為尋找致病突變，根據(jù)定位的候選區(qū)域內(nèi)基因信息，直接針對兩個中國人TPTPS家系患者進行了候選區(qū)域基因LMBR1/C7ORF2、HLX139、RNF32、NOM1、C7ORF13、LOC389602、LOC393076、 LOC39

7、3889和LOC393890外顯子及兩側部分內(nèi)含子區(qū)域的直接測序研究，結果沒有發(fā)現(xiàn)相應的致病性序列改變。應用VISTA軟件對人類、小鼠和非洲爪蟾的非編碼序列進行了同源性比對，在PPD/TPT候選區(qū)域內(nèi)選擇10個高度保守的調(diào)控序列區(qū)域(包括ZRS)，直接在TPTPS患者中進行了測序檢測，結果亦未見突變。此外，還在兩個PPD/TPT家系中進行了ZRS突變檢測和初步功能研究。在其中一個墨西哥人PPD/TPT家系中，發(fā)現(xiàn)一個ZRS-402處C>

8、T的點突變。ZRS-402處C高度保守，在各種已知物種中都為C。在墨西哥人群隨機篩查118條染色體未見該點突變出現(xiàn)于正常人群，提示這是一個導致PPD/TPT表型的新的ZRS突變。在另外一個中國人PPD/TPT家系中未發(fā)現(xiàn)ZRS的突變。進一步應用斑馬魚(zebrafish)增強子-GFP-Tol轉座子表達系統(tǒng)對新發(fā)現(xiàn)的人類ZRS突變進行斑馬魚體內(nèi)表達研究。結果顯示，GFP報告基因從受精后30小時(hourspost-fertiliz,at