mGluR1a誘導(dǎo)的丘腦皮質(zhì)神經(jīng)元生理病理性電活動及其神經(jīng)分子機制.pdf

1、本文通過激活代謝性谷氨酸受體(metabotropicglutamatereceptor，mGluR)亞型mGluR1a誘導(dǎo)丘腦中繼核團的丘腦皮質(zhì)(Thalamocortical，TC)神經(jīng)元的生理性和病理性電反應(yīng)活動，揭示其內(nèi)在的細(xì)胞和神經(jīng)分子機制。 包括3個部分：第一部分研究貓外側(cè)膝狀體核(LateralGeniculateNucleus，LGN)、腹基底復(fù)合體(ventrobasalcomplex,VB)、內(nèi)側(cè)膝狀體核(m

2、edialgeniculatenucleus，MGB)和腹外側(cè)核(ventrallateralnucleus，VL)，大鼠和小鼠LGN、VB區(qū)TC神經(jīng)元生理性的＜1Hz慢波特征，比較這些不同種屬和核團間＜1Hz慢波的共同和不同特性，試圖揭示＜1Hz慢波的這些特征與其在睡眠過程中所起的功能之間的相關(guān)性。 第二部分研究小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元alpha(α)和theta(θ)節(jié)律的特征，以及縫隙連接(gapjunctions，GJs)

3、對α/θ節(jié)律同步化的影響和連接蛋白(connexin，Cx)45的作用，試圖揭示這些生理性同步化節(jié)律產(chǎn)生的丘腦神經(jīng)分子機制。 第三部分研究過度激活mGluR1a所誘導(dǎo)的小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元產(chǎn)生病理性的棘慢復(fù)合波(spikeandwavedischarges，SWDs)及其特征，初步闡述這些高度異常同步化活動在TC神經(jīng)元之間傳播的途徑，而且mGluR1a受體激活誘導(dǎo)這種SWDs可作為一種較為穩(wěn)定的模型來研究丘腦在癲癇發(fā)作時所起的

4、作用和機制。 結(jié)果 第一部分TC神經(jīng)元產(chǎn)生的＜1Hz慢波在不同種屬和核團的特征 1)貓LGN、VB、MGB和VL區(qū)TC神經(jīng)元＜1Hz慢波的共同特征 ①對照條件下，LGN、VB、MGB和VL區(qū)TC神經(jīng)元均不能產(chǎn)生＜1Hz慢波，細(xì)胞內(nèi)記錄應(yīng)用非特異性的mGluRⅠ/Ⅱ激動劑trans-ACPD(100μM)后，則分別有60％、54％、56％和73％的TC神經(jīng)元產(chǎn)生＜1Hz的慢波。 ②＜1Hz慢波的基本

5、特征：形態(tài)呈立體的(stereotypical)改變，UP和DOWN之間膜電位差值在～20mV左右；每個UP的開始總伴隨低門控Ca2+電位(lowthresholdCa2+potentials，LTCP)調(diào)節(jié)的脈沖；UP和DOWN的轉(zhuǎn)換有一個很明顯的膜電位形態(tài)變化的標(biāo)志；在DOWN時出現(xiàn)超級化激活的混合的陽離子電流(Ⅰh)，引起細(xì)胞膜緩慢的去極化。 2)貓LGN、VB、MGB和VL區(qū)TC神經(jīng)元＜1Hz慢波的特異性①在LGN區(qū)細(xì)胞

6、內(nèi)記錄顯示約67％的＜1Hz慢波表現(xiàn)為“靜止的(quiescent)”UP狀態(tài)，其余約33％的＜1Hz慢波呈“活躍的(active)”UP狀態(tài)。其它3個區(qū)除VB區(qū)有1例“active”UP外，其余均為“quiescent”UP狀態(tài)；②在LGN、VB、MGB和VL區(qū)細(xì)胞外記錄到的慢波呈“quiescent"UP狀態(tài)分別占44％、81％、86％和86％；而“active”UP分別占56％、19％、14％和14％；③將細(xì)胞內(nèi)外記錄所得到的“a

7、ctive”慢波比率綜合考慮，則LGN、VB、MGB和VL區(qū)分別為44％、16％、11％和10％；④細(xì)胞外記錄LGN、VB、MGB和VL區(qū)TC神經(jīng)元產(chǎn)生的慢波頻率分別為：0.28±0.03Hz，0.32±0.01Hz，0.25±0.03Hz及0.27±0.04Hz。 3)大鼠LGN和VB區(qū)的＜1Hz慢波特征①在對照條件下，大鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元RN為198.0±18.0MΩ，靜息膜電位(Vm)為-64.8±0.9mV，無＜1Hz

8、慢波出現(xiàn)。②細(xì)胞外記錄大鼠LGN和VB區(qū)的結(jié)果顯示能產(chǎn)生慢波的TC神經(jīng)元比率分別占50％和45％；③細(xì)胞外記錄時LGN和VB區(qū)慢波頻率分別為0.3±0.05Hz及0.41±0.04Hz。 4)小鼠LGN和VB區(qū)的＜1Hz慢波特征①在對照條件下，小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元RN為140.2±22.5MΩ，靜息膜電位(Vm)為-60.2±1.2mV，無＜1Hz慢波出現(xiàn)。②小鼠LGN和VB區(qū)TC神經(jīng)元細(xì)胞外記錄的結(jié)果顯示＜1Hz慢波的存在，

9、比率分別為78％和27％；③LGN和VB區(qū)TC神經(jīng)元慢波頻率分別為0.38±0.04Hz及0.51±0.09Hz。 結(jié)論：能夠產(chǎn)生＜1Hz慢波是脊椎動物TC神經(jīng)元的一個共同特征，具有明顯的種屬和功能核團相關(guān)的特異性，這種特異性有可能與它們在睡眠過程中的功能活動及所起的作用有關(guān)。 第二部分mGluR1a誘導(dǎo)的小鼠丘腦外側(cè)膝狀體Alpha和Theta節(jié)律 1)trans-ACPD誘導(dǎo)小鼠TC神經(jīng)元產(chǎn)生α和θ節(jié)律①在對

10、照條件下，細(xì)胞外記錄小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元無自發(fā)活動；②α/θ節(jié)律不受NMDA、非NMDA、GABAA和GABAB受體抑制劑及選擇性mGluR5受體抑制劑MPEP30μM的影響；③細(xì)胞內(nèi)記錄約9.5％的細(xì)胞在膜電位＞-56mV時產(chǎn)生頻率在4-16Hz范圍的HTB。 2)縫隙連接抑制劑可逆的抑制小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元α/θ節(jié)律在對照條件下(trans-ACPD150μM)LGN區(qū)約20％的TC神經(jīng)元產(chǎn)生同步化α或θ節(jié)律，加入無活性

11、的glycyrrhetinicacid衍生物glycyrrhizicacid(GZA)后，α/θ節(jié)律的頻率和峰值均無明顯改變(p＞0.05)；然而在給予傳統(tǒng)的縫隙連接抑制劑18β-glycyrrhetinicacid(18β-GA，100μM)和Carbenoxolone(CBX，150μM)后，α/θ節(jié)律均受抑制，沒有明顯的頻率分布范圍，峰值與對照組相比分別降低21％±9.7％和40％±14％(p＜0.01)。 3)Dye-c

12、oupling顯示小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元之間存在縫隙連接微電極內(nèi)充灌低分子量Biocytin作為染料，綜合細(xì)胞內(nèi)記錄，免疫組化和圖像分析等技術(shù)進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)有25％小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元呈染料偶聯(lián)現(xiàn)象。 4)Cx45對小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元同步化的α/θ節(jié)律的影響①應(yīng)用trans-ACPD150μM后，Cx45基因敲除型小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元也可產(chǎn)生同步化的α/θ節(jié)律；Cx45野生型和Cx45基因敲除型小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元HT

13、B的比率分別為20.5％和20％(p＞0.05)；②Cx45野生型和Cx45基因敲除型小鼠TC神經(jīng)元α節(jié)律的頻率分別為12.7±2.37Hz(7.9-22Hz)和11.7±2.16Hz(8.3-18Hz)；θ節(jié)律頻率為6.20±0.45Hz(4.0-7.8Hz)和6.40±0.62Hz(5.8-7.0Hz)(p＞0.05)。 結(jié)論：小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元能夠產(chǎn)生同步化的α/θ節(jié)律，mGluR1a的激活是其產(chǎn)生的機制之一，受HTB

14、的驅(qū)使，縫隙連接對α/θ節(jié)律的同步化起重要作用，然而Cx45在這些同步化電活動中所起的作用有限，很可能還有其它Cx的作用。 第三部分mGluR1a誘導(dǎo)的小鼠丘腦外側(cè)膝狀體病理性的SWDs1)Trans-ACPD誘導(dǎo)小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元的SWDs小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元受到強烈的刺激時(≥200μMtrans-ACPD)，約36％的細(xì)胞能產(chǎn)生一種與病理性的非典型的癲癇異常發(fā)作(AtypicalAbsenseParoxysms)的S

15、WDs非常相似的高度同步化放電活動，其振幅常＞0.5mV，波形呈棘峰樣，呈緊密的神經(jīng)元同步化。 2)小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元SWDs的表現(xiàn)特征①一系列動作電位之后出現(xiàn)頻率逐漸減慢的HTB脈沖循環(huán)，SWD之間為靜止期；②SWD之間為＜1Hz的慢波；③背景為連續(xù)的動作電位，SWD出現(xiàn)其中，神經(jīng)元呈連續(xù)放電，沒有靜息期。 3)縫隙連接對小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元SWDs的影響應(yīng)用傳統(tǒng)的縫隙連接阻斷劑18β-GA(100μM)，觀察到

16、單位放電(singleunit)和場電位的高度同步化的異常發(fā)作性放電活動均被抑制。 結(jié)論：過度激活mGluR1a可以誘導(dǎo)小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元產(chǎn)生SWDs，其特征與整體實驗觀察到的極其相似，它們的傳播受縫隙連接的影響。mGluR1a誘導(dǎo)的SWDs可作為一種穩(wěn)定的體外癲癇失神性發(fā)作的研究模型。 總結(jié)人類和一些動物的腦電活動表現(xiàn)一種周期性的節(jié)律性的變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)離體的丘腦腦片能夠不依賴于大腦皮層的活動而自發(fā)產(chǎn)生這些腦電

17、活動，提示丘腦在這些節(jié)律性的腦電活動中起著我們尚未認(rèn)識到的積極的作用，對于在腦電圖上表現(xiàn)的一些節(jié)律活動而言，丘腦很可能起到一種“起博”點的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)＜1Hz的慢波在丘腦TC神經(jīng)元的表達(dá)既存在種屬和核團間的共同性，也表現(xiàn)差異性。這從一定程度上解釋了在睡眠過程中，各個功能核團既需要維持一個基本的警覺程度，同時也表現(xiàn)不同的功能核團對外界不同刺激的感覺差異的生理機制。此外，小鼠LGN區(qū)TC神經(jīng)元也具有像較高等動物(如貓等)那樣產(chǎn)生生理性和