廣西不同產(chǎn)地何首烏DNA、HPLC指紋圖譜研究.pdf

1、目的：
　　1.建立何首烏ISSR–PCR的實驗體系及鑒別方法，探討廣西不同產(chǎn)地何首烏親緣關(guān)系，并對不同產(chǎn)地何首烏進行遺傳多樣性分析，為廣西產(chǎn)何首烏優(yōu)質(zhì)種源的開發(fā)提供質(zhì)量依據(jù)；
　　2.探討廣西不同產(chǎn)地何首烏的質(zhì)量狀況，并對其相似度進行評價，為廣西不同產(chǎn)地何首烏的鑒別和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用ISSR分子標記技術(shù)對廣西不同產(chǎn)地何首烏進行分子生藥學(xué)研究，篩選最佳的總 DNA提取方法，通過 I

2、SSR–PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳對PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，篩選出特異性擴增引物，鑒別廣西不同產(chǎn)地何首烏，建立DNA指紋圖譜。此外，還應(yīng)用相關(guān)分析軟件MVSP3.2和Popgene32對樣品進行聚類分析和遺傳多樣性分析。
　　2.通過高效液相色譜法建立何首烏指紋圖譜，為完善廣西何首烏質(zhì)量體系提供依據(jù)。摸索并確定合適的色譜分離條件，選擇穩(wěn)定性好、色譜峰豐富的提取方法對樣品進行提取，并進行相關(guān)方法學(xué)考察，對廣西不同產(chǎn)地何首烏進行對比分

3、析，使用“計算機輔助相似度評價軟件”進行數(shù)據(jù)處理，對10批何首烏藥材進行相似度比較分析。
　　結(jié)果:
　　1.何首烏總DNA提取方法：CTAB法。
　　2.何首烏ISSR–PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：25μl反應(yīng)體系包括1×Taq酶配套緩沖液，1.8m mol·L–1MgCl2，200μmol·L–1dNTP，0.2μmol·L–1引物，1UTaq DNA聚合酶，DNA模板約50 ng。相應(yīng)的擴增程序為：①94℃預(yù)變性5mi

4、n；②94℃變性30s；③50℃退火1min；④72℃延伸2min；⑤2～4步驟循環(huán)45次；⑥72℃延伸10min。
　　3.何首烏的DNA指紋圖譜研究：選用40條ISSR擴增引物，從中篩選出9條穩(wěn)定性好、譜帶清晰的引物。通過擴增共獲得清晰的條帶117條，其中多態(tài)性條帶111條，擴增片段的多態(tài)性達到94.87％。其中，引物UBC–840能清晰穩(wěn)定地區(qū)分桂平、田林、桂林、賀州四個產(chǎn)地的何首烏，可作為鑒別何首烏的特異性引物，實現(xiàn)產(chǎn)地間

5、鑒別。此外，引物UBC–815、UBC–845、UBC–852可鑒別出田林、桂林兩個產(chǎn)地何首烏；引物UBC–835、UBC–876可鑒別出桂平、桂林兩個產(chǎn)地何首烏，引物UBC–818可鑒別出田林、賀州兩個產(chǎn)地何首烏。通過UPGMA聚類分析中相似度可知，何首烏根據(jù)ISSR標記劃分的類型同地理分布有一定關(guān)系，地理位臵較近的樣品多聚在一起。Shannon多樣性指數(shù)和Nei遺傳多樣性指數(shù)都一致地表明田林、賀州這兩個種源的遺傳多樣性要比何首烏種源

6、遺傳多樣性的平均水平高，另外兩個何首烏種源的多態(tài)性則低于何首烏種源多態(tài)性的平均水平。ISSR是鑒別廣西不同產(chǎn)地何首烏的有效方法。
　　4.何首烏的HPLC指紋圖譜的研究：樣品提取方法，以甲醇超聲處理30 min為佳,其峰信息較多,保留時間有較好的穩(wěn)定性與重復(fù)性。色譜條件以安捷倫Agilent TC–C18(5μm,4.6 mm×250mm)，乙腈–水為流動相進行梯度洗脫，流速為0.8ml·min–1，柱溫30℃，檢測波長為280n

7、m，進樣量10μl。本研究參照峰為何首烏中重要的活性成分二苯乙烯苷。經(jīng)方法學(xué)考察表明，建立的實驗方法切實可靠，符合建立指紋圖譜的相關(guān)規(guī)定。借助中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，共匹配得到6個共有物質(zhì)峰。得到10批何首烏藥材的指紋圖譜，并生成對照圖譜。運用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》，計算各批藥材間的相似度和各批藥材與對照指紋圖譜間的相似度。
　　結(jié)論:
　　1.運用ISSR分子標記對廣西不同產(chǎn)地何首烏進行IS

8、SR鑒別研究，建立了最佳實驗體系；篩選出9條穩(wěn)定性好、譜帶清晰的引物，并得到了用于鑒別的特異性引物 UBC–840；運用軟件 MVSP3.2和Popgene32對擴增結(jié)果進行統(tǒng)計分析，證實廣西不同產(chǎn)地何首烏遺傳關(guān)系的差別并進行了遺傳多樣性分析；探討了ISSR作為何首烏分子生藥學(xué)鑒別有效方法的實驗過程，方法可行。
　　2. HPLC–FPS實驗結(jié)果反映出廣西不同產(chǎn)地何首烏中各種成分的差異，為何首烏藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為進一步制定