一種大鼠肝癌干細(xì)胞的離心富集方法.pdf

1、近年來，腫瘤干細(xì)胞（Cancer Stem Cells, CSCs）假說在相關(guān)領(lǐng)域掀起了巨大的騷動，此學(xué)說認(rèn)為：腫瘤是由其自身的干細(xì)胞所維持的。這群細(xì)胞或者處于休眠狀態(tài)或者不斷的分裂出腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，也參與了腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機制。進一步的了解CSCs的特點將有助于早期預(yù)防腫瘤發(fā)生和增加腫瘤治療方法的選擇性。近幾年從多種腫瘤中成功的分離出CSCs，比如乳腺癌、前列腺癌、腦癌和結(jié)腸癌等等，盡管如此，干細(xì)胞的存在與否仍然是

2、個備受爭議的話題。
　　肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是一種高度惡性腫瘤，因其轉(zhuǎn)移早，預(yù)后差，如何治療HCC是醫(yī)學(xué)界的一大世界性難題。肝癌干細(xì)胞（Hepatic cancer stem cells, HCSCs）是體外研究治療策略的非常好的模型，正是如此，HCSCs的分離與鑒別是至關(guān)重要的，只有獲得了純正的HCSCs，后續(xù)的研究才有可信度。目前常用的分選HCSCs的方式種類繁多，主要是針對其

3、表面分子標(biāo)志物的識別如CD133和EpCAM，應(yīng)用熒光活化細(xì)胞分選系統(tǒng)（Fluorescence-activated Cell Sorting, FACS）及磁性活化細(xì)胞分選系統(tǒng)（Magnetic-activated Cell Sorting, MACS）來分選，然而，分選HCSCs的標(biāo)志物特異性是有爭議的。為了彌補這個缺憾，有不少學(xué)者嘗試?yán)酶杉?xì)胞能夠?qū)晒馊玖螲oechst33342或者羅丹明123外排的特性，通過FACS篩選出邊緣

4、群（Side Population, SP）細(xì)胞的方法富集HCSCs，此方法非常有效，但是最近的研究表明，染料Hoechst33342可損傷細(xì)胞以致影響實驗的準(zhǔn)確性，以及SP細(xì)胞的假陽性，這些都限制了該方法的廣泛應(yīng)用。因此我們選擇了另外一種方法，即密度梯度離心。根據(jù)前期我實驗室建立的分離胎肝干/祖細(xì)胞(Fetal Liver Stem/Progenitor Cells, FLSPCs)的三步分離法，我們以改進的設(shè)計進行大鼠HCSCs的分

5、離。
　　研究目的：
　　基于 HCSCs的物理特性，使用Percoll連續(xù)密度梯度離心方法富集HCSCs，并通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、功能學(xué)等方法檢測其是否具有干性，最后以非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（Non-Obese Diabetic mice with Severe Combined Immunodeficiency Disease, NOD/SCID mice）成瘤實驗來驗證所分選細(xì)胞的致瘤能力。
　　研究方法：

6、
　　F334大鼠行二乙基亞硝胺（Diethylnitrosamine, DENA）腹腔注射建立肝癌模型，確認(rèn)成癌后提取原代肝癌細(xì)胞并體外培養(yǎng)，經(jīng)過差速消化法初步純化細(xì)胞，擴增至足量后行Percoll連續(xù)密度梯度離心，根據(jù)密度指示珠標(biāo)識將細(xì)胞分為四層并繼續(xù)培養(yǎng)。
　　首先將所分選細(xì)胞分別行透射電鏡、鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞的形態(tài)，并做AFP和CK-19免疫熒光染色確定細(xì)胞來源。其次通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光實時定量檢測各層細(xì)胞的CSC

7、s標(biāo)記水平。繼而通過繪制生長曲線、Transwell實驗檢驗各層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，最后行NOD/SCID小鼠成瘤實驗檢測細(xì)胞的致瘤能力。
　　研究結(jié)果：
　　Percoll離心所得四層細(xì)胞，由AFP和CK-19免疫熒光染色可知均為肝細(xì)胞性肝癌來源；透射電鏡、鬼筆環(huán)肽染色發(fā)現(xiàn)第3層細(xì)胞有干細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)，且纖毛和偽足較多；生長曲線、侵襲實驗均可見第3層細(xì)胞具有最強的增殖、遷移和侵襲能力；流式細(xì)胞術(shù)得出第3層細(xì)胞EpC

8、AM與AFP陽性表達最高，分別為（84.5±8.31）％和（85.2±8.31）％；Realtime-PCR證實，第3層細(xì)胞的EpCAM和AFP的mRNA表達最高，分別為（111.34±5.59）和（13.76±0.95），第3層的CD133表達為（17.16±0.42），與第2層、4層差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但與第1層差異無統(tǒng)計學(xué)意義；NOD/SCID小鼠成瘤實驗顯示，1×104個/ml濃度的第3層細(xì)胞成瘤率為100％，且成瘤最早、體積最大

9、，移植瘤鏡下顯示為腫瘤細(xì)胞且來源為肝細(xì)胞性肝癌，同時觀察到肝臟也受到了不同程度的侵害，充分說明了此層細(xì)胞的致瘤能力強，并可能歸巢性的損傷了肝臟。
　　研究結(jié)論及意義：
　　利用Percoll連續(xù)密度梯度離心從原代培養(yǎng)的大鼠肝癌細(xì)胞中分離出的第3層細(xì)胞，形態(tài)學(xué)上與CSCs相似，功能學(xué)中增殖、侵襲和致瘤能力均強于其他層腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過證實，此層細(xì)胞就是我們所需要的HCSCs。
　　該實驗方法與表面標(biāo)志分選相比，雖然精度稍差，