RasGRP3在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用及機制的研究.pdf

1、第一部分RasGRP3在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞及B細胞中的表達
　　目的：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,SLE)是以自身抗體的產生為特征的累及多個器官和組織的自身免疫病,內源性的高反應性B淋巴細胞是狼瘡發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。SLE患者中存在免疫分子的表達異?？蓪е翨CR通路持續(xù)性激活,而RasGRP3(Rasguanylnucleotidereleasingprotein3,Ras鳥苷

2、酸釋放蛋白3)主要在B細胞中表達,為BCR信號通路下游重要分子。本實驗研究RasGRP3在SLE患者外周血單個核細胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)中的表達,并進一步提取PBMC中的B細胞,研究RasGRP3在SLE患者外周血B細胞中的表達,并探討其在SLE發(fā)病免疫機制的意義。
　　方法：收集臨床上確診SLE患者的外周血標本20例,以及正常志愿者20例,Ficoll法提取SLE患者及正常人

3、外周血中的PBMC,采用免疫磁珠分選法純化B細胞,流式檢測B細胞的純度。使用RT-PCR方法檢測SLE患者及正常人PBMC和B細胞中RasGRP3的mRNA表達及用WesternBlot方法檢測蛋白的表達。其中10例標本用于PBMC中RasGRP3mRNA表達分析,5例標本用于RasGRP3蛋白表達分析,5例標本用于純化B細胞,檢測B細胞中RasGRP3mRNA的表達
　　結果：免疫磁珠分選法分選B細胞,其純度能達到90％以上。S

4、LE患者PBMC中RasGRP3的mRNA和蛋白質的表達水平明顯高于正常人。在純化后的B細胞中,與正常人相比,SLE患者RasGRP3的mRNA表達水平也明顯升高。
　　結論：SLE患者外周血PBMC及B細胞中RasGRP3的mRNA和蛋白水平均較正常人高,提示B細胞中RasGRP3的異常表達可能參與狼瘡發(fā)病。
　　第二部分SLE患者PBMC中RasGRP3的mRNA水平與臨床資料的關聯(lián)
　　目的：研究RasGRP3的

5、mRNA表達與SLE患者臨床特征的聯(lián)系,探討其表達增高是否與SLE臨床體征,實驗室檢查結果,病情活動程度有關。
　　方法：收集臨床上確診SLE患者26例用于分析PBMC中RasGRP3mRNA水平與臨床特征的關聯(lián),Ficoll法提取PBMC,RT-PCR方法半定量檢測其mRNA表達。通過回歸統(tǒng)計分析SLE患者疾病活動程度與其PBMC中RasGRP3的mRNA表達的相關性。根據(jù)患者臨床特征以及實驗室檢查結果分組,使用T檢驗研究Ras

6、GRP3的mRNA表達在每兩組間有無差異。
　　結果：SLE患者PBMC中RasGRP3的mRNA表達水平與SLE疾病活動指數(shù)(SLEDAI)成正相關(p=0.0301),并且疾病活動期患者較靜止期患者PBMC中RasGRP3的mRNA水平顯著增加(p<0.05)。血尿、蛋白尿的SLE患者與非血尿、蛋白尿的患者相比,RasGRP3的mRNA表達顯著增加(p<0.05)。
　　結論：RasGRP3可能為反應狼瘡疾病活動的指標之

7、一,并與腎臟損害有關,但本次研究樣本量偏小,仍需大樣本研究進一步驗證。
　　第三部分地塞米松對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中RasGRP3表達的影響
　　目的：分別體內外研究糖皮質激素對SLE患者PBMC中RasGRP3的作用,探討糖皮質激素通過抑制RasGRP3的表達治療SLE的機制。
　　方法：選取臨床上使用糖皮質激素(約1mg/kg強的松)的SLE患者10例,抽取其糖皮質激素治療前及治療后兩周的外周血,提取PBMC。其中5

8、例檢測治療前后PBMC中RasGRP3的mRNA表達水平,5例檢測蛋白表達水平。在體外實驗中,使用兩種不同濃度地塞米松(1×10-5、1×10-6mol/L),與正常人PBMC細胞共同培養(yǎng),在孵育時間為0h,12h,24h提取細胞,使用RT-PCR的方法檢測RasGRP3的mRNA水平,選取合適的濃度。另外收集未經(jīng)治療的SLE患者6例,使用該濃度的地塞米松共孵育,觀察不同時間點(0h、12h、24h)的地塞米松對PBMC中RasGRP3

9、的mRNA水平的影響。并在地塞米松孵育0h,24h,48h提取細胞,使用westernblot方法檢測RasGRP3蛋白水平及下游信號通路p-ERK,p-AKT的水平。
　　結果：未使用糖皮質激素治療時,SLE患者PBMC中RasGRP3的表達高于正常人,使用中等劑量糖皮質激素治療2周后,RasGRP3的表達明顯下降,接近正常人的表達水平。地塞米松能抑制正常人PBMC中RasGRP3的mRNA表達,1×10-6mol/L濃度的地塞

10、米松對RasGRP3表達的有抑制作用且未明顯引起細胞凋亡。使用該濃度的地塞米松與SLE患者PBMC共培養(yǎng),觀察不同時間點地塞米松對RasGRP3的抑制作用。我們發(fā)現(xiàn),24h時地塞米松對PBMC內RasGRP3的mRNA及蛋白水平抑制作用最強。同時在24h地塞米松能明顯抑制PBMC中pERK及p-AKT的表達。
　　結論：SLE患者在臨床治療時,使用糖皮質激素治療2周后,PBMC中RasGRP3的水平下降。地塞米松能抑制正常人及SL