microRNA-429在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中的表達及其與P53表達的關(guān)系.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜癌(endometrialcarcinoma，EC)是原發(fā)于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，為婦科三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20％-30％。近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率不斷上升，且有年輕化趨勢。盡管多年來對子宮內(nèi)膜癌開展了大量的研究，目前對于子宮內(nèi)膜癌的確切病因仍不太清楚。因此，探索子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制，攻克這一疾病是目前亟待解決的問題。microCRNA(簡寫為miRNA，miR)是一類由大約19—25個核苷酸組成

2、的非編碼小分子RNA，能夠通過堿基互補配對的方式，與特異的靶mRNA的3'UTR或編碼區(qū)域結(jié)合，進而抑制靶mRNA的翻譯或直接降解mRNA，最終抑制基因的表達。早在1993年，Lee等在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA——lin-4，2000年又發(fā)現(xiàn)了第二個miRNA——let-7，從此掀起了miRNA研究的熱潮。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在細胞的生長發(fā)育、分化、增殖、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程中都發(fā)揮著重要作用。不同的miRNA對細胞

3、生長具有不同的調(diào)控作用，相同的miRNA對不同細胞株的調(diào)控作用亦不同。而且miRNA可調(diào)節(jié)眾多癌基因和抑癌基因，在腫瘤中miRNA表達異常上調(diào)或下調(diào)。近來，作為眾多miRNA基因組中一員的miR-200家族，在腫瘤學上的作用越來越受到重視。miR-200家族主要包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429五個成員。根據(jù)編碼miRNA-200家族的基因定位可分為:miR-200a/miR-200

4、b/miR-429和miR-200c/miR-141兩組，在人類，miR-200a/miR-200b/miR-429編碼基因位于1號染色體p36.33，而miR-200c/miR-141編碼基因位于12號染色體p13.31。在研究miRNA的過程中，Wu等利用基因芯片檢測10組子宮內(nèi)膜組織，與對照組相比子宮內(nèi)膜癌組織中17個miRNAs表達上調(diào)，6個miRNAs表達下調(diào)，其中miR-429表達上調(diào)。梁靜等利用基因芯片研究子宮內(nèi)膜樣腺癌組

5、織中miRNA差異表達譜時，也發(fā)現(xiàn)miR-429的表達明顯上調(diào)。最近國外也有人檢測到miR-200家族在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達，且在子宮內(nèi)膜癌細胞中應用anti-miR-200家族后發(fā)現(xiàn)anti-miR-429能顯著抑制Ishikawa細胞的生長。研究還發(fā)現(xiàn)miRNA與P53關(guān)系密切，與P53在多種腫瘤的發(fā)生過程中形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。P53是目前腫瘤界研究最多最深入的抑癌基因之一，定位于17號染色體短臂17p13.1，該基因具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄

6、、抑制細胞生長、誘導凋亡的作用，而它的突變和缺失是導致許多腫瘤發(fā)生的原因。研究表明P53與子宮內(nèi)膜癌的臨床分級、病理分型、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且有文獻報道P53與術(shù)后血清CA125的水平相一致，兩者結(jié)合可以作為判斷預后、指導臨床治療的指標之一。本實驗旨在通過在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中轉(zhuǎn)染miRNA-429的反義寡核苷酸(AS-miR-429)抑制miRNA-429的表達，觀察miRNA-429被抑制后子宮內(nèi)膜癌Is

7、hikawa細胞的增殖與凋亡情況，并研究子宮內(nèi)膜癌細胞中miRNA-429與P53之間是否存在表達作用關(guān)系，探討miRNA-429在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制，從而為子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷及治療提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:1.用含10％FBS胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞。2.待細胞90％融合時轉(zhuǎn)染，將實驗分四組:空白對照組（即不轉(zhuǎn)染組）、陰性對照組

8、（即轉(zhuǎn)染無關(guān)序列miR-429抑制劑組）、實驗組（即轉(zhuǎn)染特異性miR-429抑制劑組）、轉(zhuǎn)染試劑組（即只加入轉(zhuǎn)染試劑組）。3.用CCK-8檢測轉(zhuǎn)染后細胞的增殖活性變化。4.用Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的凋亡情況。5.用實時定量RT-PCR檢測miR-429和P53的相對表達量。6.用Westernblot檢測P53的蛋白表達。7.采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　 結(jié)果:相比空白

9、對照組和轉(zhuǎn)染試劑組，實驗組和陰性對照組細胞的生長都受到明顯抑制（陰性對照組細胞增殖活性低于實驗組）;實驗組的細胞凋亡明顯增多，凋亡率為（28.45±2.62）高于空白對照組（3.34±1.02）和轉(zhuǎn)染試劑組（4.19±1.13），但低于陰性對照組（41.23±3.62），與各組間比較均有顯著性差異(P＜0.05)。實時定量檢測結(jié)果顯示在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中有miR-429的表達，實驗組及陰性對照組中miR-429的表達量明顯

10、低于空白對照組和轉(zhuǎn)染試劑組，相應兩組中P53mRNA的表達量也有所下降;Westernblot檢測結(jié)果顯示實驗組P53蛋白的表達有所上調(diào)，但與空白對照組和轉(zhuǎn)染試劑組相比差異不顯著(P＞0.05)，而陰性對照組P53蛋白的表達下調(diào)。
　　 結(jié)論:在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中有miR-429的表達，在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中加入AS-miRNA-429雖然可以抑制P53mRNA的表達、抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡，但不具