兔蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼IL-6、TNF-α、ICAM-1的表達(dá)及其治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 干眼是指由于淚液的量或質(zhì)的異常引起的淚膜不穩(wěn)定和眼表面損害，從而導(dǎo)致眼不適癥狀的一類疾病，其臨床表現(xiàn)主要是眼疲勞，異物感，干澀感，燒灼感，畏光流淚眼紅等癥狀。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，干眼的發(fā)病率有明顯增高趨勢(shì)。 美國國立眼科研究所干眼研究組將干眼分為淚液生成不足型和蒸發(fā)過強(qiáng)型兩種。前者臨床上以干燥性角結(jié)膜炎(KCS)和Sjogren綜合征(SS)最為多見。后者則包括瞼板腺功能障礙(MGD)、暴露及

2、角膜接觸鏡等因素所致的干眼癥。 近年來免疫學(xué)和分子生物學(xué)的研究進(jìn)展使我們對(duì)干眼的病因有了更新的認(rèn)識(shí)，細(xì)胞因子作為一類由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的高活性蛋白質(zhì)多肽分子，參與了免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，在干眼的發(fā)病機(jī)制中起到了十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，眼表面的免疫反應(yīng)和炎癥是影響干眼病情的一個(gè)非常重要的因素，SS和KCS患者的結(jié)膜、淚腺活檢標(biāo)本內(nèi)和淚液中均發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥反應(yīng)標(biāo)記物表達(dá)，尤其是發(fā)現(xiàn)白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TIF-a

3、)、細(xì)胞間粘附因子(ICAM-1)等含量和表達(dá)增加，并和干眼的損害程度成正相關(guān)。然而蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼發(fā)病機(jī)制是否也有細(xì)胞因子參與還未得到證實(shí)。 γ-亞麻酸是一種必需脂肪酸，具有廣泛的生理活性和明顯的藥理作用。國外有實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)KCS有一定療效，但具體作用機(jī)制不詳。動(dòng)物模型是進(jìn)行臨床和基礎(chǔ)研究的載體。本實(shí)驗(yàn)采取對(duì)蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼模型兔和正常兔眼角膜、結(jié)膜和淚液中炎癥標(biāo)記物細(xì)胞因子IL-6、TNF-a的測定，以及粘附分子ICAM-1在角

4、膜結(jié)膜組織當(dāng)中的表達(dá)，觀察這三種因子在蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼中表達(dá)和變化，從而明確炎性因子在蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼發(fā)病機(jī)制中的作用。同時(shí)治療組干眼兔給予口服γ-亞麻酸，觀察治療前后三種因子在上述組織中的變化及組織的病理改變，探討γ-亞麻酸在治療蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼時(shí)的效果和機(jī)制，從而為臨床使用及推廣此藥提供理論依據(jù)。 方法: 1 選用健康新西蘭大白兔30只，雌雄不分，體重2-2.5kg，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，第1組10只兔，為正常組；第2組

5、10只兔，為對(duì)照組；第3組10只兔，為藥物治療組。 2 干眼模型制作：對(duì)照組和治療組兔采取手術(shù)顯微鏡下燒灼器逐個(gè)燒灼瞼板腺開口的方法封閉瞼板腺口，術(shù)后每天觀察兔角膜熒光素染色、Schirmer試驗(yàn)和淚膜破裂時(shí)間(break uptime BUT)的變化，術(shù)后6周，根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為成功制成干眼模型。 3 成功制成干眼模型后，治療組給予γ-亞麻酸膠囊灌胃治療，50mg，2次/天，共5周。模型組及正常組未予任何處理。用藥后每

6、日觀察三組兔角膜熒光素染色、Schirmer試驗(yàn)和淚膜破裂時(shí)間的變化。 4 收集兔淚液：在盡量減少人為刺激的條件下，分別取正常組、對(duì)照組和治療組1、3、6、9、11周兔的淚液，分別用放免法及酶免法檢測淚液中IL-6、TNF-a的含量。 5 術(shù)后11周處死三組兔，取兔角膜及結(jié)膜組織行病理切片檢查，采用放免法及酶免法檢測三組兔角膜、結(jié)膜組織勻漿后IL-6、TNF-a的含量，同時(shí)應(yīng)用免疫組化方法檢測ICAM-1在三組兔角膜結(jié)膜組織的表

7、達(dá)情況。 6 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值用x±s表示，采用單因素方差分析方法和兩樣本t檢驗(yàn)，SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出其臨床意義。 結(jié)果: 1 根據(jù)制作蒸發(fā)過強(qiáng)型兔干眼模型前后測量Schirmer Ⅰ試驗(yàn)、BUT、熒光素染色的變化(p<0.01)及干眼診斷標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示到第6周時(shí)，干眼模型達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)。用藥5周后觀察各項(xiàng)指標(biāo)顯示治療組兔Schirmer Ⅰ試驗(yàn)濾紙濕長較對(duì)照組增加，淚膜破裂時(shí)間延長，熒

8、光素染色評(píng)分下降，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異(p<0.01)。 2 術(shù)后6周三組兔淚液中IL-6、TNF-a含量對(duì)比，對(duì)照組與正常組相比較明顯增高(t=43.656；t=52.117)，治療組與正常組相比較明顯增高(t=52.503,t=51.692)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異(p<0.001)。對(duì)照組與治療組比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著性差異(t=0.628,p>0.05)。 3 術(shù)后11周組織病理學(xué)觀察：對(duì)照組角膜上皮細(xì)胞

9、層次增加，表面扁平細(xì)胞不規(guī)則缺失，基質(zhì)層水腫增厚，細(xì)胞成分增多，可見炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)膜上皮細(xì)胞排列不規(guī)則，層次增加，杯狀細(xì)胞減少，基底層細(xì)胞見核分裂相，可見炎性細(xì)胞浸潤，治療組角膜上皮較完整，基質(zhì)層厚度接近正常組，結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增加，但仍較正常組少，細(xì)胞排列較規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤減少。 4 術(shù)后11周三組兔IL-6、TNF-a含量對(duì)比，淚液中對(duì)照組含量高于正常組(t=19.815；t=19.313)，治療組中的含量明顯低于對(duì)

10、照組(t=16.794；t=16.834)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異(p<0.001)，治療組含量高于正常組，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著性差異(t=2.263；t=0.334，p>0.05)。角膜組織勻漿液中，對(duì)照組含量高于正常組(t=27.051；t=21.613)，治療組中的含量明顯低于對(duì)照組(t=24.730；t=19.788)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異(p<0.001)，治療組含量高于正常組，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著性差異(t=1.3

11、68；t=3.499，p>0.05)。結(jié)膜組織勻漿液中，對(duì)照組含量高于正常組(t=36.087；t=22.456)，治療組中的含量明顯低于對(duì)照組(t=42.925；t=28.574)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異(p<0.001)，治療組含量高于正常組，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著性差異(t=2.845；t=0.474，p>0.05)。 5 ICAM-1在三組兔角膜結(jié)膜組織上皮均有表達(dá)，陽性反應(yīng)物呈棕黃色，主要表達(dá)于細(xì)胞漿。每1000個(gè)細(xì)

12、胞陽性表達(dá)數(shù)角膜正常組為52.24±5.88，對(duì)照組為272.12±46.76，治療組為60.34±10.21；結(jié)膜正常組為60.36±15.34，對(duì)照組為302.67±56.28，治療組為74.32±21.45，對(duì)照組與正常組比較ICAM-1的表達(dá)明顯增加(t=26.384；t=30.572，p<0.001)，治療組與對(duì)照組相比較角膜結(jié)膜上皮ICAM-1的表達(dá)的明顯下降(t=25.021；t=29.894，p<0.001)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處

13、理有顯著性差異。 結(jié)論: 1 蒸發(fā)過強(qiáng)型兔干眼模型角膜、結(jié)膜組織勻漿液及淚液中細(xì)胞因子IL-6、TNF-a含量比正常兔增高，細(xì)胞因子在蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用，蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼的發(fā)病機(jī)制與炎癥有關(guān)。 2 粘附分子ICAM-1在蒸發(fā)過強(qiáng)型兔干眼模型角膜、結(jié)膜上皮表達(dá)與正常兔相比明顯增強(qiáng)，蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼的發(fā)病機(jī)制有粘附分子的參與，與T淋巴細(xì)胞滲透有關(guān)。 3 γ-亞麻酸通過降低眼表細(xì)胞因子表達(dá)、抑制T淋巴