HB-EGF對大鼠腸道淤血再灌注及肝臟缺血再灌注損傷保護作用的研究.pdf

1、在肝臟外科，為減少手術(shù)過程中的出血常需阻斷第一肝門，這勢必造成肝臟缺血和腸道淤血，而隨后的肝門開放，則不可避免地造成肝臟的缺血再灌注損傷及腸道的淤血再灌注損傷。在肝臟移植領(lǐng)域，也不可避免地會涉及到這些損傷。如何有效地減輕這些損傷，一直是國內(nèi)外學者研究的熱點。
　　 肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子(Heparin-binding epidermal growthfactor-like growth factor，HB-EGF)作為

2、一種細胞保護因子對組織器官起保護作用，近年來越來越受到關(guān)注。HB-EGF是表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)家族中的一員。后來的研究表明，HB-EGF基因廣泛表達，HB-EGF可減少氧自由基的產(chǎn)生，并對多種細胞具有促有絲分裂的作用。
　　 HB-EGF可以減輕大鼠腸道缺血再灌注損傷時的細菌移位和炎癥因子的表達，可增加壞死性腸炎時腸道微血管血流量，改善失血性休克后腸道的微循環(huán)。肝臟方面，HB-E

3、GF在大鼠肝臟部分切除后可通過旁分泌的方式促進肝臟的再生，轉(zhuǎn)基因小鼠模型實驗也證實該因子可以促進肝切除術(shù)后的肝臟再生。有研究認為HB-EGF對肝細胞的保護和促有絲分裂能力比肝細胞生長因子更強。大鼠腸道發(fā)生缺血再灌注損傷時，腸管內(nèi)注射HB-EGF對肺也起到保護作用。
　　 HB-EGF對腸道缺血再灌注損傷保護作用的動物實驗研究多是通過阻斷腸系膜上動脈血供的方法進行，但HB-EGF對肝門阻斷后腸道淤血損傷的保護作用尚未見報道。研究表

4、明，淤血性損傷較缺血性損傷更為嚴重、損傷恢復更為緩慢。淤血與缺血存在不同之處，因此淤血再灌注損傷過程與缺血再灌注損傷亦有不同。
　　 針對肝臟缺血再灌注損傷及腸道淤血再灌注損傷這一常見的臨床問題，并鑒于HB-EGF對腸系膜上動脈阻斷所致的腸道缺血再灌注損傷有比較確切的保護作用，而目前尚未見HB-EGF對腸道淤血再灌注損傷保護作用的研究，其對肝臟缺血再灌注損傷有無保護作用也未見報道，我們設(shè)計動物實驗進行相關(guān)的研究。我們采用Prin

5、gle's法建立第一肝門阻斷的大鼠模型，觀察HB-EGF是否可以減輕腸道的淤血再灌注損傷。更進一步的研究，我們模擬肝臟移植手術(shù)，建立經(jīng)門靜脈灌注的大鼠自體肝臟移植模型，觀察HB-EGF對肝臟缺血再灌注損傷是否也起保護作用，并從炎癥反應(yīng)的角度對HB-EGF保護肝臟的機制進行初步探討。
　　 第一章:HB-EGF對大鼠腸道淤血再灌注損傷保護作用的研究
　　 目的:
　　 探討HB-EGF是否對第一肝門阻斷所造成的大鼠

6、腸道淤血再灌注損傷起保護作用。
　　 材料和方法:
　　 1.實驗動物和材料
　　 雄性Sprague-Dawley大鼠，樣本量為30只，周齡7～9周，體重213-256 g。清潔級，飼養(yǎng)條件符合SPF級標準，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。HB-EGF購自美國R&D Systems公司。
　　 2.動物模型的建立
　　 大鼠術(shù)前禁食12小時，不禁水。采用乙醚吸入麻醉，備皮消毒后取腹部正中縱行切口入

7、腹。顯露第一肝門，Pringle's法阻斷第一肝門，30分鐘后去除血管夾，關(guān)腹。再灌注6小時后再次經(jīng)原切口開腹取腸道、血清標本。
　　 3.實驗分組
　　 30只SD大鼠隨機分成3組:假手術(shù)組（Sham，n=10），腸道淤血再灌注組(C/R，n=10)和HB-EGF治療組(C/R+HB-EGF，n=10)。
　　 假手術(shù)組給予除夾閉第一肝門以外的上述同樣平行處理。HB-EGF治療組在第一肝門阻斷15分鐘時，經(jīng)空腸

8、-回腸交界處向腸管內(nèi)注入HB-EGF(劑量為600μg/kg，與含0.1％ BSA的PBS液配成1 ml)。腸道淤血再灌注組在同一時間以同樣的方法注入1ml含0.1％ BSA的PBS液。
　　 4.觀察指標
　　 4.1腸道組織病理學觀察
　　 取末段回腸，組織經(jīng)甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋與切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。并根據(jù)其病理損傷程度評分（Chiu評分）。
　　 4.2血清炎癥因子的含量
　　

9、 經(jīng)下腔靜脈取血，采用ELISA法測定各組血清標本中TNF-α和IL-1β的含量。
　　 4.3腸道組織髓過氧化物酶(MPO)活性
　　 4.4腸道組織丙二醛(MDA)含量
　　 硫代巴比妥酸法測定腸道組織MDA含量
　　 4.5腸道上皮細胞凋亡指數(shù)（AI）
　　 采用TdT介導的dUTP缺口末端標記法（Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated

10、deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling assay,TUNEL)檢測腸道上皮細胞凋亡情況，凋亡指數(shù)定義為TUNEL陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比。
　　 5.統(tǒng)計學分析
　　 數(shù)據(jù)均以(x)±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。多組頻數(shù)表資料的比較采用Kruskal-Wallis H。多組均數(shù)方差齊性，采用單因素方差分析(one-wayANOVA)及LSD兩

11、兩比較;多組均數(shù)方差不齊，采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3兩兩比較。統(tǒng)計分析中，檢驗標準為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.腸道組織病理學改變
　　 Sham組腸粘膜未見損傷;C/R組可見絨毛頂端下間隙增寬，部分絨毛脫落、破潰以及炎癥細胞浸潤;與C/R組相比，C/R+HB-EGF組回腸組織的病理損傷明顯減輕。C/R+HB-EGF組回腸組織Chiu病理評分顯著低于C/R組(P=0.002)

12、。
　　 2.血清炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量
　　 C/R組血清TNF-α和IL-1β的含量顯著高于Sham組(P=0.000，P=0.000);C/R+HB-EGF組TNF-α和IL-1β的含量顯著低于C/R組(P=0.031，P=0.038)。
　　 3.腸道組織MPO活性
　　 假手術(shù)組、腸道淤血再灌注組、HB-EGF治療組的MPO活性分別為(0.49±0.10)、（1.28±0.18）和

13、（0.89±0.15）U/g。腸道淤血再灌注組MPO活性顯著高于假手術(shù)組(P=0.000)，HB-EGF治療組MPO活性顯著低于腸道淤血再灌注組(P=0.000)。
　　 4.腸道組織MDA含量
　　 假手術(shù)組、腸道淤血再灌注組、HB-EGF治療組的MDA含量分別為(1.32±0.23)、（3.05±0.39）和（2.39±0.27）nmol/mg protein。腸道淤血再灌注組MDA含量顯著高于假手術(shù)組(P=0.00

14、0)，HB-EGF治療組MDA含量顯著低于腸道淤血再灌注組(P=0.000)。
　　 5.腸道上皮細胞凋亡指數(shù)(AI)
　　 腸道上皮細胞呈現(xiàn)棕褐色者為TUNEL陽性細胞。假手術(shù)組、腸道淤血再灌注組、HB-EGF治療組的AI分別為（7.83±2.01）、（66.08±10.61）和(51.22±9.98)％。腸道淤血再灌注組AI顯著高于假手術(shù)組(P=0.000)，HB-EGF治療組AI顯著低于腸道淤血再灌注組(P=0.0

15、14)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實驗?zāi)Ｐ蜅l件下，大鼠腸道淤血30分鐘再灌注6小時可造成顯著的淤血再灌注損傷。
　　 2.腸管內(nèi)HB-EGF給藥可以減輕腸道的淤血再灌注損傷，其保護作用體現(xiàn)在HB-EGF可減輕腸道組織的病理損傷、降低炎癥因子的表達、減少組織中炎癥細胞的浸潤、減輕腸道組織的氧化應(yīng)激損傷以及抑制腸道上皮細胞的凋亡。
　　 第二章:HB-EGF對大鼠肝臟缺血再灌注損傷保護作用的研究
　　

16、 目的:
　　 模擬肝臟移植手術(shù)，建立穩(wěn)定的大鼠全肝缺血再灌注損傷模型。觀察該模型條件下HB-EGF是否對肝臟也起保護作用，并對HB-EGF保護肝臟的機制進行初步探討。
　　 材料和方法:
　　 1.實驗動物和材料
　　 雄性Sprague-Dawley大鼠，樣本量為30只，周齡7～9周，體重217-255 g。清潔級，飼養(yǎng)條件符合SPF級標準，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。HB-EGF購自美國R&D

17、Systems公司。
　　 2.大鼠自體肝移植模型（全肝血流阻斷+經(jīng)門靜脈灌注）的建立
　　 大鼠術(shù)前禁食12小時，不禁水。采用乙醚吸入麻醉，備皮消毒后取腹部正中縱行切口入腹。分離切斷肝周韌帶，充分游離肝臟;結(jié)扎并切斷左膈下靜脈、肝食管韌帶靜脈和右腎上腺靜脈;游離肝上下腔靜脈和肝下下腔靜脈;打開肝十二指腸韌帶，解剖第一肝門，游離門靜脈、肝動脈和膽總管。至此除了出入肝臟的管道，肝臟已經(jīng)完全游離。
　　 無創(chuàng)血管夾夾

18、閉門靜脈和肝動脈，并開始計時;穿刺針順血流方向刺入門靜脈并予血管夾固定穿刺針，經(jīng)穿刺針注射2ml肝素鹽水(35 U/ml)使大鼠全身肝素化;阻斷肝上下腔靜脈和肝下下腔靜脈，并在肝下下腔靜脈的血管夾上方剪開約1mm的靜脈壁作為流出道。4℃含肝素(12.5 U/ml)的乳酸林格液(20ml)以2.5 ml/min的速度通過輸液泵經(jīng)穿刺針行門靜脈灌注，在灌注的同時以4℃乳酸林格液澆注肝臟表面降溫。
　　 灌注完成后拔出門靜脈穿刺針，9

19、-0 prolene線修補門靜脈穿刺點，8-0prolene線修補肝下下腔靜脈流出道;計時滿30分鐘后解除所有血管夾，結(jié)束無肝期;肝臟表面予38℃生理鹽水澆注以快速復溫;關(guān)腹。
　　 再灌注6小時后再次經(jīng)原切口開腹取肝臟、血清標本。
　　 3.實驗分組
　　 30只SD大鼠隨機分成3組:假手術(shù)組(Sham，n=10)，肝臟缺血再灌注組(I/R，n=10)和HB-EGF治療組(I/R+HB-EGF，n=10)。

20、r>　　 假手術(shù)組只將肝臟完全游離，不行血管穿刺、阻斷。HB-EGF治療組在門靜脈阻斷15分鐘時，經(jīng)空腸-回腸交界處向腸管內(nèi)注入HB-EGF(劑量為600μg/kg，與含0.1％BSA的PBS液配成1ml)。肝臟缺血再灌注組在同一時間以同樣的方法注入1ml含0.1％ BSA的PBS液。
　　 4.觀察指標
　　 4.1血清ALT水平
　　 4.2肝臟組織病理學觀察
　　 取右葉肝臟，組織經(jīng)甲醛固定，常規(guī)

21、石蠟包埋與切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。并根據(jù)其病理損傷程度評分（Suzuki評分）。
　　 4.3肝細胞凋亡指數(shù)(AI)
　　 4.4肝臟組織髓過氧化物酶(MPO)活性
　　 4.5炎癥因子的含量
　　 經(jīng)下腔靜脈取血，采用ELISA法測定各組血清標本中TNF-α和IL-1β水平的變化。肝臟組織勻漿后ELISA法測定各組肝臟組織中TNF-α和IL-1β的含量。
　　 4.6肝臟組織細胞間粘附

22、分子-1（ICAM-1）免疫組織化學法檢測各組肝臟組織ICAM-1的表達情況。
　　 4.7肝臟組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)和NF-κB抑制因子α(IκBα)蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）法檢測各組肝臟核蛋白中NF-κB p65的表達情況以及總蛋白中IκBα的含量。
　　 5.統(tǒng)計學分析
　　 數(shù)據(jù)均以(x)±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。多組均數(shù)方差齊性，采

23、用單因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD兩兩比較;多組均數(shù)方差不齊，采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3兩兩比較。統(tǒng)計分析中，檢驗標準為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.血清ALT水平
　　 I/R組血清ALT水平顯著高于Sham組（P=0.000），I/R+HB-EGF組血清ALT水平顯著低于I/R組(P=0.034)。
　　 2.肝臟組織病理學改變
　　 S

24、ham組肝臟未見損傷;I/R組可見明顯的肝細胞腫脹、胞漿空泡形成、肝竇充血和炎性細胞浸潤;與I/R組相比，I/R+HB-EGF組肝臟的病理損傷明顯減輕。I/R+HB-EGF組肝臟Suzuki病理評分顯著低于I/R組(P=0.045)。
　　 3.肝細胞凋亡指數(shù)（AI）
　　 肝細胞呈現(xiàn)棕褐色者為TUNEL陽性細胞。Sham組、I/R組和I/R+HB-EGF組的AI分別為(1.55±0.52)、(14.72±1.98)和(

25、12.18±1.82)％。I/R組AI顯著高于Sham組(P=0.000)，I/R+HB-EGF組AI顯著低于I/R組(P=0.023)。
　　 4.炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量
　　 I/R組血清TNF-α和IL-1β水平顯著高于Sham組(P=0.000，P=0.000);I/R+HB-EGF組TNF-α和IL-1β水平顯著低于I/R組(P=0.013，P=0.027)。
　　 I/R組肝臟組織TNF

26、-α和IL-1β的含量顯著高于Sham組(P=0.000，P=0.000);I/R+HB-EGF組TNF-α和IL-1β的含量顯著低于I/R組(P=0.045，P=0.023)。
　　 5.肝臟組織MPO活性
　　 Sham組、I/R組和I/R+HB-EGF組的MPO活性分別為（0.88±0.10）、(1.87±0.13）和（1.72±0.11）U/g。I/R組MPO活性顯著高于Sham組(P=0.000)，I/R+HB

27、-EGF組MPO活性顯著低于I/R組(P=0.005)。
　　 6.肝臟組織細胞間粘附分子-1（ICAM-1）的表達
　　 Sham組未見或僅見微量的ICAM-1表達;I/R組ICAM-1的表達顯著增加，尤其是在肝竇內(nèi)皮細胞和中央靜脈內(nèi)皮細胞呈強陽性表達;HB-EGF可明顯下調(diào)ICAM-1在肝臟的表達。
　　 7.肝臟組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)和NF-κ3抑制因子α（IκBα）的表達

28、>　　 與Sham組相比，I/R組肝臟核蛋白中NF-κB p65的表達顯著增強(P=0.000)，HB-EGF可顯著抑制I/R大鼠肝臟核蛋白中NF-κB p65的表達(P=0.000)。
　　 與Sham組相比，I/R組肝臟中IκBα的含量顯著降低(P=0.000)，而HB-EGF給藥后顯著提高了I/R大鼠肝臟總蛋白中IκBα的含量(P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1.HB-EGF可以減輕大鼠自體肝移植