臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫學(xué)特性研究及其臨床應(yīng)用初步探討.pdf

1、目的本研究旨在建立一種標(biāo)準(zhǔn)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcord derived mesenehymal stem cells，LJC-MSCs)分離方法，通過對(duì)其基本生物學(xué)特性、安全性、免疫學(xué)特性及臨床治療移植物抗宿主病作用的研究，以期建立臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫及應(yīng)用于臨床。 方法本實(shí)驗(yàn)研究分五部分：1.采用雙酶法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過傳代進(jìn)行純化和擴(kuò)增培養(yǎng)，繪制生長曲線；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原及細(xì)

2、胞周期；誘導(dǎo)向成骨、脂肪分化以觀察其多項(xiàng)分化潛能；采用軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)以觀察其致瘤性；急性毒性實(shí)驗(yàn)以觀察其急性毒性反應(yīng)。 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其免疫表型；用Brdu法測(cè)定細(xì)胞增殖率，觀察UC-MSCs對(duì)異體T淋巴細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)體系中CD4+、CD8+水平；ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ的表達(dá)水平 3.以雄性C57BL/6(H-2kb)小鼠為供鼠、照射后的雌性BALB/c(H-2k

3、d)小鼠為受鼠，在移植物中混合不同比例的供鼠脾淋巴細(xì)胞以誘導(dǎo)急性移植物抗宿主病。根據(jù)臨床表現(xiàn)、存活期及病理檢查等判斷GVHD程度，以建立穩(wěn)定的小鼠aGVHD模型。4.采用雄性C57BL/6(H-2kb)小鼠為供鼠、銫(Cs)137致死量照射的雌性BALB/c(H-2kd)小鼠為受鼠建立不同的移植組：照射組、GVHD組、治療組。根據(jù)生存率、臨床表現(xiàn)和病理改變判斷GVHD程度，并比較不同移植組的存活率、GVI-1D發(fā)生情況。5.于2006年

4、10月～2007年2月，應(yīng)用臍帶問充質(zhì)干細(xì)胞移植治療3例GVHD患者(急性GVHD患者1例，慢性GVHD患者2例)。從足月兒臍帶分離出來間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外經(jīng)過分離培養(yǎng)后，制成臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，靜脈輸注患者體內(nèi)進(jìn)行療效觀察。 結(jié)果:成功建立了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離及培養(yǎng)擴(kuò)增的方法；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，貼壁細(xì)胞均表達(dá)CD29、CD44、CD166、CD105、CD106,不表達(dá)造血細(xì)胞表型CD34、CD45和CD31；細(xì)胞倍

5、增時(shí)間為30h，細(xì)胞周期分析表明，G0～G1期和s+G2+M期所占比例分別為78.84％和11.16％，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在軟瓊脂中無克隆形成、無急性毒性反應(yīng)。從臍帶獲得的MSCs免疫表型分析顯示，其不表達(dá)HLA-Ⅱ抗原、CD80、CD86。對(duì)PHA刺激的臍帶血T淋巴細(xì)胞,UC-MSCs對(duì)其的增殖反應(yīng)具有抑制作用；UC-MSCs與臍帶血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，CD8+細(xì)胞比例降低，與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0101)，CD4+細(xì)胞比例無明

6、顯變化(P＞0.05)；UC-MSCs抑制了共培細(xì)胞養(yǎng)體系中IFN-γ分泌，然而促進(jìn)了IL-4的分泌，與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.01)。異基因骨髓移植組無典型的急性GVHD，aGVHD組的臨床評(píng)分在8分左右，存活期集中在14-30天，臨床和病理均可在相對(duì)集中的時(shí)間內(nèi)觀察到典型的急性GVHD改變.在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)開始輸注間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠預(yù)防和減輕GVHD的發(fā)生。和GVHD組比較，治療組生存期、GVHD臨床癥狀和皮膚病理變化具有明顯

7、好轉(zhuǎn)，具有顯著性差異(p＜0.05)。在臨床觀察中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輸注后所有患者均未見不良反應(yīng)；隨訪1月，3例急慢性GVHD例患者具有不同程度恢復(fù)。 結(jié)論:雙酶法是一種較好的分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，培養(yǎng)的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特性，無致瘤性和急性毒性反應(yīng)，為建立間充質(zhì)干細(xì)胞庫和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。UC-MSCs能夠抑制PHA刺激的T淋巴的增殖，改變T細(xì)胞亞群及T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，這種抑制特性表明，UC-MSCs對(duì)免