聯(lián)合應用胰島素與艾迪苯醌對糖尿病大鼠血腦屏障通透性的影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病是以慢性高血糖及多器官系統(tǒng)并發(fā)癥為特征的疾病，治療的主要目的是降低血糖，減少或延緩癥狀及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。糖尿病腦病是糖尿病常見的并發(fā)癥之一。在糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展過程中，血腦屏障結構和功能的改變可能是糖尿病腦病早期的病理生理學改變之一。血腦屏障結構的破壞、通透性的增加，神經元在高血糖、以及高血糖引起的氧化應激、炎癥因子等一系列因素刺激下，發(fā)生凋亡、變性、甚至壞死。有報道證明糖尿病是神經系統(tǒng)退行性病變以及癡呆發(fā)生

2、的危險因素，降糖藥物的使用可以減緩退行性病變的發(fā)生和發(fā)展，但對于胰島素等降糖藥物對糖尿病血腦屏障功能的作用尚無一致性報道。緊密連接蛋白是保持血腦屏障完整性的結構基礎，在緊密連接相關蛋白家族中，occludin、claudin-5是兩個代表性分子，有報道腦微血管內皮細胞的緊密連接相關蛋白occludin、claudin-5的表達減少與血腦屏障通透性的增加相關。
　　糖尿病時的高血糖狀態(tài)，使細胞產生氧化應激反應。氧自由基的產生增加，誘

3、導多種炎性因子產生增加，增加了細胞毒性作用，使血管內皮細胞及神經細胞等損傷。維生素E、姜黃素作為抗氧化劑在實驗性糖尿病大鼠的治療中顯示出了對抗減少自由基產生起的DNA和蛋白質損傷，從而保護糖尿病大鼠神經元和上皮細胞功能的作用。艾迪苯醌是一種臨床上使用的抗氧化劑，目前尚無艾迪苯醌對糖尿病血腦屏障影響方面的報道。
　　本文旨在研究探討胰島素與艾迪苯醌單獨及聯(lián)合應用對糖尿病大鼠血腦屏障的影響及其可能機制，為糖尿病的血管神經病變的治療提供

4、新的實驗依據。
　　方法:
　　1、鏈脲菌素誘導的糖尿病大鼠模型的復制及實驗分組
　　成年雄性Wister大鼠，禁食不禁水12小時后給予一次性腹腔注射1.3％（溶于檸檬酸鹽緩沖液pH值4.2-4.5）鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)60mg/kg體重，以給藥2周后血糖值不低于16.7mol/l的大鼠做為糖尿病大鼠。隨機分為糖尿病組、胰島素給藥組、艾迪苯醌給藥組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組，并設空白給藥組

5、（等劑量生理鹽水腹腔注射）做為對照。
　　2、胰島素及艾迪苯醌給藥
　　給予鏈脲菌素2周后大鼠用藥各組給予治療用藥，胰島素給藥組給予胰島素8U/kg，日兩次腹腔注射;艾迪苯醌給藥組給予艾地本醌30mg/kg，日一次灌胃給藥;胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合給藥組給予胰島素與艾迪苯醌同時給藥。體重及飲水隨時監(jiān)測，血糖監(jiān)測采用尾尖取血法利用血糖儀進行監(jiān)測。
　　3、伊文氏蘭滲透實驗檢測血腦屏障通透性
　　伊文氏蘭(Evans b

6、lue,EB)滲透試驗用來檢測鏈脲菌素誘導的糖尿病大鼠血腦屏障通透性的變化，空白組做對照。選擇STZ給藥前，STZ造模2周，STZ造模4周，STZ造模8周，STZ造模12周做為時間觀察點檢測糖尿病大鼠血腦屏障通透性變化;給予STZ造模2周后，給予胰島素及艾迪苯醌治療用藥，以治療2周、6周、10周為時間觀察點采用EB滲透試驗檢測胰島素及艾迪苯醌對血腦屏障通透性影響。
　　4、Western blot實驗
　　治療用藥10周提取

7、大腦皮質血管，提取蛋白樣品應用western blot實驗檢測occludin，claudin-5蛋白表達。取大腦皮質血管蛋白檢測糖基化終術產物受體(receptor for advanced glycation end product，RAGE)蛋白表達，應用試劑盒提取大腦皮質血管核蛋白檢測腦皮質NF-κB P65蛋白表達。
　　5、透射電鏡觀察
　　治療用藥10周取材，應用電鏡檢測大鼠血腦屏障超微結構變化。
　　6

8、、ELISA實驗
　　治療用藥10周取材，提取大鼠腦皮質應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay, ELISA)檢測腦皮質晚期糖基化終術產物(advancedglycation end products，AGEs)含量。
　　7、統(tǒng)計分析
　　SPSS11.0軟件分析實驗結果，實驗結果采用means±SD.兩兩比較采用t檢驗。多組比較采用單因素方差分析，多重比較P＜0.05

9、認為有顯著性差異。
　　結果:
　　一、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用對糖尿病大鼠血腦屏障的影響
　　1、伊文氏蘭滲透試驗檢測血腦屏障通透性顯示糖尿病大鼠血腦屏障通透性隨糖尿病病程進展變化
　　STZ給藥2周和4周時，糖尿病組與對照組相比血腦屏障通透性有增高趨勢，但無統(tǒng)計學差異。STZ給藥8周和12周時，糖尿病組與對照組相比血腦屏障通透性顯著增高。
　　2、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用增加糖尿病大鼠體重
　　與

10、對照組相比，治療前，治療2周、6周、10周各時間點，糖尿病組與對照組相比體重顯著降低;與糖尿病組相比，在治療2周、6周、10周時間點，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組均顯著增加了大鼠的體重。
　　3、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用降低糖尿病大鼠飲水量
　　與對照組相比，在治療前，治療2周、6周、10周各時間點，糖尿病組與對照組相比飲水量顯著增加;與糖尿病組相比，在治療2周、6周、10周時間點，胰島素組、艾迪苯醌組、

11、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組均顯著降低了大鼠的飲水量。
　　4、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用降低糖尿病大鼠血糖
　　與對照組相比，在治療前，治療2周、6周、10周各時間點，糖尿病組和艾迪苯醌組分別與對照組相比血糖均顯著增加;與糖尿病組相比，在治療2周、6周、10周時，胰島素組和胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組的血糖值均顯著降低，艾迪苯醌組的血糖值未見明顯變化。
　　5、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用降低糖尿病大鼠血腦屏障通透性
　

12、　在治療前和治療2周，對照組、糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組各組間的EB含量無統(tǒng)計學意義的變化;在治療6周，與對照組相比，糖尿病組和艾迪苯醌組的EB含量分別顯著增高;與糖尿病組相比，胰島素組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組顯著降低了EB含量;在治療10周，與對照組相比，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組的EB含量均顯著增加;與糖尿病組相比，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組的

13、EB含量均顯著降低。
　　6、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用保護血腦屏障的完整性
　　對照組的腦微血管內皮間的緊密連接致密，處于關閉狀態(tài)，糖尿病組緊密連接處于輕微的開放狀態(tài)，胰島素組、艾迪苯醌組及聯(lián)合給藥組電鏡下的緊密連接均接近于對照組，處于關閉狀態(tài)。
　　7、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用上調糖尿病大鼠大腦微血管段occludin和claudin-5蛋白表達
　　與對照組比較，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯

14、醌聯(lián)合應用組的大鼠腦微血管段occludin的表達均顯著降低;與糖尿病組相比較，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組分別顯著增加了occludin的表達。與對照組比較，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組的大鼠腦微血管段claudin-5的表達均顯著降低;與糖尿病組相比較，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組分別顯著增加了claudin-5的表達。
　　二、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用對鏈

15、脲菌素誘導糖尿病大鼠血腦屏障的影響機制研究
　　1、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用降低糖尿病大鼠腦微血管段AGEs含量
　　與對照組相比，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組的AGEs含量均顯著增加;與糖尿病組相比，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組的AGEs含量均顯著降低
　　2、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用降低糖尿病大鼠腦微血管段RAGE，NF-κB P65的蛋白表達
　　與對照組相

16、比，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組的RAGE蛋白表達均顯著增加;與糖尿病組相比，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組的RAGE蛋白表達均顯著降低。與對照組相比，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組的NF-κB蛋白表達均顯著增加;與糖尿病組相比，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用組的NF-κB蛋白表達均顯著降低。
　　結論:
　　1、胰島素與艾迪苯醌單獨以及聯(lián)合應用分別顯著增加了糖

17、尿病大鼠的體重，降低了飲水量，胰島素及聯(lián)合應用降低了糖尿病大鼠的血糖值。
　　2、胰島素與艾迪苯醌單獨以及聯(lián)合應用分別顯著降低了糖尿病大鼠的血腦屏障通透性;胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用在降低糖尿病大鼠血腦屏障通透性上存在協(xié)同作用。
　　3、胰島素與艾迪苯醌單獨以及聯(lián)合應用分別顯著增加了糖尿病大鼠的腦微血管段occludin和claudin-5的蛋白表達，胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應用在增加緊密連接相關蛋白occludin上存在協(xié)同作用