共刺激分子CD80分子上調(diào)Graves病免疫應(yīng)答的臨床和實驗研究.pdf

1、第一部分: 目的：探討可能影響甲亢患者服藥后再次復(fù)發(fā)的多種危險因素。 方法：選取96例初診Graves病患者，正規(guī)抗甲亢藥物治療(ATD)一年,然后繼續(xù)進(jìn)行為期半年的隨訪觀察,評價治療效果。將分為治療緩解組和復(fù)發(fā)組。ELISA法測定血清TRAb濃度，熒光定量PCR測定外周血單個核細(xì)胞表面共刺激分子CD80 mRNA含量，溫和酸消化法測定血清總碘含量。以血清總碘含量、TRAb濃度、外周單核細(xì)胞(PBMC)膜上CD80mRN

2、A含量等可能影響甲亢治療預(yù)后的危險因素為自變量，以ATD一年半后緩解或復(fù)發(fā)為應(yīng)變量，結(jié)合其他臨床參數(shù)進(jìn)行病例對照研究，做多因素條件logistic回歸分析。直線相關(guān)分析TRAb和CD80 mRNA以及血清總碘含量的相關(guān)性。 結(jié)果：多因素logistic回歸模型確定系數(shù)R2=0.783（p=0.007），進(jìn)入回歸模型的危險因素有：TRAb 濃度（βj＝0.565，OR＝5.506），家族史（βj＝0.528，OR＝3.401），C

3、D80mRNA 含量（βj＝0.453，OR＝3.089），血清總碘含量（βj＝0.389，OR＝1.497），發(fā)病年齡（βj＝0.272，OR＝1.301）。相關(guān)性分析顯示：血清TRAb 濃度(r=0.79)和CD80含量之間的相關(guān)性大于血清總碘(r=0.45)。 結(jié)論：CD80含量和血清TRAb濃度相關(guān)性高于血清總碘含量。患者TRAb 濃度增高、具有甲亢陽性家族史、PBMC表面CD80mRNA表達(dá)量增高、血清總碘含量增高、發(fā)

4、病年齡早可能是導(dǎo)致ATD復(fù)發(fā)的重要危險因素。 第二部分: 目的：構(gòu)建表達(dá)mCD80基因真核質(zhì)粒載體。大量擴(kuò)增并提純pcDNA3.0-hTSHR質(zhì)粒和pcDNA3.0-mCD80質(zhì)粒。獲得瞬時表達(dá)hTHR的CHO細(xì)胞，為測定第二信使cAMP提供檢測載體。 方法:用RT-PCR方法獲得Balb/C鼠CD80基因全長序列,插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0。降重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-mCD80,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α

5、篩選陽性克隆,雙酶切和基因測序鑒定。脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.0-hTSHR轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并用Western blot免疫印記法檢測轉(zhuǎn)染產(chǎn)物的表達(dá)。 結(jié)果:重組質(zhì)粒雙酶切后凝膠電泳產(chǎn)生兩條大小分別為5.4kb和2.7kb的片斷，大小和預(yù)期相同?；蚬緶y序結(jié)果與Genebank中的全長序列一致。在700ug/ml的G418濃度壓力下，獲得瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,Western blot結(jié)果表明該蛋白具有明顯的免疫增強(qiáng)作用。 結(jié)

6、論:用基因工程技術(shù)獲得mCD80基因真核表達(dá)質(zhì)粒,為進(jìn)一步研究CD80分子的對甲亢免疫應(yīng)答過程的影響奠定了基礎(chǔ)。 第三部分: 目的：探討基因槍注射和普通質(zhì)粒肌肉注射兩種不同方法對甲亢動物模型的差異。 方法：對45只小鼠進(jìn)行隨機(jī)分成四組，分別用基因槍金顆粒包裹質(zhì)粒免疫、普通質(zhì)粒肌肉注射免疫。加強(qiáng)免疫后第4周后處死小鼠RIA 法測定血清FT3、FT4、TSH水平。RIA法測定血清與hTSHR-CHO孵育后上清cAMP

7、濃度以計算TRAb 活性，RIA法測定脾臟培養(yǎng)后IL-4的濃度，ELISA法測定血清TSAb 濃度，取甲狀腺做石蠟HE切片觀察組織學(xué)變化。 結(jié)果：基因槍免疫組(GGI)動物4周后血清FT4（0.34±0.11）pg/ml高于質(zhì)粒肌肉注射組(PLS)（0.21±0.06）pg/ml和基因槍免疫空質(zhì)粒組(GG0)（0.17±0.08）pg/ml（F=14.34，p=0.002）。GGI組TRAb活性（167.27±37.37）％高于

8、PLS組（113.81±25.50）％和GG0組（98.27±14.80）％（Hc=35.198，p＝0.007）。GGI組脾臟培養(yǎng)上清液IL-4產(chǎn)量（0.244±0.092）pmol/L明顯高于PLS組（0.173±0.039）pmol/L和GG0組（0.151±0.041）pmol/L(F=7.0403，p＝0.005)。GGI組TRAb濃度（29.3±1.2）IU/L明顯高于GG0組（13.3±0.2）IU/L（F=9.02，p<

9、0.001），但和PLS組（24.3±0.9）IU/L比無顯著性差異（q＝-1.32，p＝0.423）。HE切片觀察造模成功小鼠甲狀腺濾泡細(xì)胞高柱狀排列，未出現(xiàn)甲狀腺細(xì)胞破壞甲狀腺炎的嗜酸性變。 結(jié)論：基因槍免疫雌性Balb/c鼠是一種可行的復(fù)制Graves動物模型，在免疫第2-4周可以觀察到FT4升高和自身抗體改變等理想的免疫效果。 第四部分: 目的:為了進(jìn)一步明確共刺激分子CD80在甲狀腺疾病中的作用和明確G

10、raves’病甲亢自身免疫疾病的病理生理機(jī)制。 方法: 40只遠(yuǎn)交系Balb/c小鼠隨機(jī)分成A，B，C，D 四組，分別為用表達(dá)pCDNA3.1-mCD80和pCDNA3.1-hTSHR的質(zhì)粒用基因槍免疫。兩周后處死小鼠，留取血清測定游離甲狀腺素（FT4）水平以確定是否造模成功，ELISA法測定血清TRAb濃度，脾臟原代培養(yǎng)7天后放射免疫法測定培養(yǎng)上清液INF-γ和IL-4濃度，離心柱粗提血清IgG后和轉(zhuǎn)染人hTSHR－CHO細(xì)胞

11、共同孵育測定培養(yǎng)液釋放cAMP濃度。HE染色切片觀察甲狀腺形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果:同時注射兩種質(zhì)粒的小鼠B組FT4水平高于其他三組(0.40±0.13)pg/ml(F=57.02，p<0.0001)，小鼠血清TRAb濃度(31.6±2.7)IU/L(F=11.90，p<0.0001)和TRAb活性(179.14±44.96)％也高于對照組。B組小鼠脾臟原代培養(yǎng)上清液IL-4的產(chǎn)量(0.226±0.029) pmol/L(F=13.2