PNPLA3在實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪肝病中的表達(dá)及其CpG島甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、研究背景：
　　近年來，非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）患病率在發(fā)展中國家及發(fā)達(dá)國家都有明顯的上升趨勢，已成為影響人類健康的第二大肝病。在西方國家，其發(fā)病率達(dá)20％-40%,在我國普通人群患病率約為15%。NAFLD被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟中的表現(xiàn)，但發(fā)病機(jī)制未明,目前較為被公認(rèn)的是“二次打擊學(xué)說”。隨著全基因組學(xué)的不斷發(fā)展，許多國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，PNPLA3基因多態(tài)性(如 rs738409、rs6006460、rs2294918、r

2、s2281135)與其密切相關(guān)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PNPLA3基因敲除的老鼠肝臟組織并無脂質(zhì)積聚。Naokikumashiro等人用specific antisense oligonucleotides(SAO)作用于高脂飲食的大鼠來降低PNPLA3mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)降低其表達(dá)可以減輕防止肝臟脂肪變性，因此推測PNPLA3脂肪合成活性可能占其主導(dǎo)地位。隨著對表觀遺傳學(xué)研究不斷深入，DNA甲基化在NAFLD中的作用越來越受到人們的重視，尤其是脂

3、質(zhì)、糖類代謝的關(guān)鍵脂肪因子、限速酶等。目前研究發(fā)現(xiàn)PNPLA3rs738409基因多態(tài)性與NAFLD密切相關(guān)，但在正常肝細(xì)胞及脂肪肝細(xì)胞中PNPLA3mRNA的表達(dá)方面并無相關(guān)報(bào)道,在脂肪肝細(xì)胞中， PNPLA3mRNA是否高表達(dá)從而使其脂肪合成活性更加占主導(dǎo)地位而引起脂肪肝？且PNPLA3啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)是否與非酒精性脂肪性肝病發(fā)病有關(guān)？
　　本研究以體外人肝L02細(xì)胞為研究對象，用油酸誘導(dǎo)建立脂肪肝細(xì)胞模型，以熒光定量PCR

4、的方法來檢測PNPLA3mRNA的表達(dá)情況，并用焦磷酸測序的方法對其CpG島甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，探討PNPLA3在NAFLD中的作用,為NAFLD的防止提供新的理論依據(jù)。
　　目的：探討PNPLA3在非酒精性脂肪肝病中的表達(dá)水平及其CpG島甲基化狀態(tài)，探討PNPLA3在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　方法：1.采用10ug/ml的油酸作用于人正常肝細(xì)胞株L02建立脂肪肝細(xì)胞模型，72h后經(jīng)油紅O染色，觀察正常組、脂肪肝模

5、型組及給藥組細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況，并用熒光定量PCR檢測PNPLA3在三組肝細(xì)胞中的表達(dá)情況。2.采用專用DNA提取試劑盒分別提取正常組、脂肪肝模型組、給藥組細(xì)胞中DNA，經(jīng)亞硫酸轉(zhuǎn)化后行PCR擴(kuò)增目的基因，并用焦磷酸測序方法檢測不同組PNPLA3 CpG島中甲基化水平，探討其在非酒精性脂肪性肝病中的作用。
　　結(jié)果：1、脂肪肝模型組肝細(xì)胞PNPLA3mRNA的表達(dá)高于正常組，經(jīng)姜黃素給藥后，其表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.

6、05）。2、在PNPLA3啟動(dòng)子區(qū)6個(gè)檢測位點(diǎn)中，脂肪肝組位點(diǎn)2甲基化水平低于正常組，姜黃素給藥后甲基化水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），在其余各檢測位點(diǎn)中甲基化水平無差異。
　　結(jié)論：1、油紅O染色染色后，脂肪肝模型組細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量紅色脂滴積聚，而正常組基本上未見脂滴，姜黃素給藥組脂滴較模型組減少，表明用10ug/ml的油酸誘導(dǎo)能成功建立體外肝細(xì)胞模型。2、PNPLA3mRNA的表達(dá)水平及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與非酒