宮頸癌HeLa細胞分泌的PGE2抑制巨噬細胞RAW中CCL5產(chǎn)生的機制研究.pdf

1、目的:宮頸癌是國內(nèi)外常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，且發(fā)病有逐年上升和年輕化的趨勢。研究顯示，炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，由于腫瘤微環(huán)境中免疫抑制性因素的存在，如前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，使得許多炎癥因子無法正常發(fā)揮作用，反而起到促瘤作用。為進一步研究宮頸癌患者中炎癥與腫瘤的關系，本實驗以培養(yǎng)宮頸癌HeLa細胞收集的上清液作為腫瘤條件培養(yǎng)基(tumorconditioned medium

2、，TCM)，觀察TCM是否會抑制巨噬細胞RAW中調(diào)節(jié)活化正常T細胞表達與分泌的趨化因子(regulated upon activationnormal T cell expressed and secreted，RANTES/CCL5)的產(chǎn)生，這種抑制效應是否由腫瘤條件培養(yǎng)基中的PGE2產(chǎn)生，并探討宮頸癌HeLa細胞分泌的PGE2對巨噬細胞中CCL5產(chǎn)生的這種抑制效應的機制，為宮頸癌的臨床治療提供新的思路。
　　方法:
　　

3、1.制備腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM):完全培養(yǎng)基培養(yǎng)對數(shù)生長期的濃度為0.6×106/ml的HeLa細胞，72小時后收集上清，0.45μm濾器過濾，-20℃保存，備用，即為TCM。
　　2.培養(yǎng)巨噬細胞RAW，用不同劑量（0，200，400，600μl）的TCM及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)（1μg/ml）刺激RAW，觀察巨噬細胞RAW中CCL5蛋白和mRNA表達。
　　3.使用不同劑量(0，10-13

4、，10-12，10-11，10-10M)的PGE2及LPS(1μg/ml)刺激巨噬細胞RAW，觀察CCL5蛋白和mRNA的表達。
　　4.使用抑制劑NS-398抑制PGE2的合成后觀察巨噬細胞RAW CCL5蛋白和mRNA的表達情況。
　　5.使用PGE2的受體拮抗劑:10μM SC51322（EP1的拮抗劑），3μMAH6809（EP2的拮抗劑）和30μM AH23848（EP4的拮抗劑）及AH6809+AH23848觀察

5、巨噬細胞的CCL5蛋白和mRNA的表達情況。
　　結果:
　　1.使用不同劑量的TCM與LPS（1μg/ml）刺激巨噬細胞RAW后，巨噬細胞內(nèi)CCL5蛋白和mRNA的表達均會下降，且這種作用具有劑量依賴性。LPS刺激前后，CCL5的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。LPS+TCM共刺激與LPS單獨刺激相比，CCL5的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.用不同劑量的PGE2及LPS（1μg/ml）刺激巨噬

6、細胞RAW，CCL5蛋白和mRNA的表達均會下降。PGE2的不同劑量組與LPS單獨刺激相比，CCL5的表達差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.用PGE2的抑制劑NS-398加入HeLa中制備TCM，用后者刺激巨噬細胞RAW后，CCL5蛋白和mRNA的表達抑制被逆轉，提示PEG2是TCM的重要成分，且其在CCL5的表達上發(fā)揮著重要的負向調(diào)節(jié)作用。
　　4.用PGE2的受體拮抗劑:10μM SC51322（EP1的拮抗

7、劑），3μMAH6809（EP2的拮抗劑），30μM AH23848（EP4的拮抗劑）及AH6809+AH23848刺激巨噬細胞RAW觀察CCL5蛋白和mRNA的表達情況:SC51322對CCL5蛋白和mRNA的表達無影響;AH6809和AH23848均會部分逆轉PGE2對CCL5蛋白和mRNA的表達的抑制效應;聯(lián)合AH6809+AH23848則會完全逆轉PGE2對CCL5蛋白和mRNA的表達的抑制效應。Med（培養(yǎng)基，medium）與

8、LPS、LPS與LPS+TCM、LPS+TCM與LPS+TCM+AH6809、LPS+TCM與LPS+TCM+AH23848、LPS+TCM與LPS+TCM+AH6809+AH23848相比，CCL5的表達差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　腫瘤條件培養(yǎng)基TCM即培養(yǎng)宮頸癌HeLa細胞制備所得，抑制巨噬細胞RAW中CCL5蛋白和mRNA的表達。根據(jù)研究這種抑制效應是由PGE2產(chǎn)生，在實驗中使用不同劑量的PG