miR-128通過靶向Galectin-3抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的抗藥性及侵襲轉(zhuǎn)移能力.pdf

1、研究背景與目的：
　　結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）的死亡率居全球惡性腫瘤的第4位，其發(fā)病率和死亡率近年在我國(guó)有持續(xù)升高的趨勢(shì)。CRC的侵襲轉(zhuǎn)移和化療不敏感是影響治療效果和生存預(yù)后的重要制約因素。因此，闡明CRC侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制并尋找新而有效的治療靶標(biāo)以抑制其侵襲轉(zhuǎn)移及增加化療敏感性是提高CRC臨床療效和降低死亡率的關(guān)鍵所在。
　　β半乳糖苷凝集素-3（Galectin-3）被稱為腫瘤相關(guān)蛋白，研究表明，

2、Galectin-3一方面參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、黏附、血管生成，另一方面還介導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，但其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本課題將進(jìn)一步明確Galectin-3在CRC侵襲轉(zhuǎn)移及化療反應(yīng)中的作用，并初步探討Galectin-3在CRC中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　研究方法：
　?。?）采用Western blot和免疫組化方法分別檢測(cè)Galectin-3在結(jié)直腸癌細(xì)胞及結(jié)直腸癌組織中的蛋白表達(dá)情況。
　?。?）構(gòu)建Gale

3、ctin-3的過表達(dá)載體及空白對(duì)照載體，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。分別應(yīng)用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Galectin-3過表達(dá)前后侵襲能力和藥物敏感性變化。
　　（3）利用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)軟件分析篩選出可能靶向調(diào)控 Galectin-3表達(dá)的miR-128。利用qRT-PCR的方法檢測(cè)了所有結(jié)腸癌細(xì)胞及Hela細(xì)胞miR-128的表達(dá)，篩選出 miR

4、-128表達(dá)水平最低的結(jié)直腸癌細(xì)胞 SW620、HT-29作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型。將has-miR128-3p minics分別轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620、HT-29后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Galectin-3的表達(dá)情況。利用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和MTS法分別檢測(cè)miR-128轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組的侵襲能力及藥物敏感性變化。將miR-128和重組有Galectin-3基因3’-UTR區(qū)miR-1

5、28潛在結(jié)合位點(diǎn)的野生型和突變型的熒光素酶報(bào)告基因分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24小時(shí)后檢測(cè)熒光素酶活性，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-128對(duì)Galectin-3的直接靶向調(diào)控作用。
　　（4）在已轉(zhuǎn)染miR-128的SW620和HT-29細(xì)胞中過表達(dá)Galectin-3，Western blot、qPCR檢測(cè)Galectin-3的表達(dá)，Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及MTS檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為變化。
　　結(jié)果：
　?。?）W

6、estern blot結(jié)果顯示：10株結(jié)直腸細(xì)胞中（Caco2、HT-29、HCT8、HCT116、SW480、SW620、LOVO、RKO、LS174T、DLD1）均普遍高表達(dá) Galectin-3。免疫組化顯示：Galectin-3在結(jié)腸癌組織中主要定位于細(xì)胞的胞漿及胞核，其陽(yáng)性表達(dá)率為86.4％，在正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率為22.0%，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Galectin-3的表達(dá)水平與是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TN

7、M分期有關(guān)（P＜0.05）；而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大直徑、分化程度、術(shù)前CEA水平無關(guān)（P＞0.05）。
　?。?）在Galectin-3表達(dá)豐度較低的Hela細(xì)胞中過表達(dá)Galectin-3后，Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組 Hela細(xì)胞遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目為（86.33±4.910）個(gè)，過表達(dá) Galectin-3的 Hela細(xì)胞遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目為（213.0±4.933）個(gè)，兩者比較

8、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。使用順鉑、奧沙利鉑、5-Fu和紫杉醇處理分別轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和Galectin-3過表達(dá)后的Hela細(xì)胞，MTS檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果提示：過表達(dá)Galectin-3的Hela細(xì)胞對(duì)順鉑、奧沙利鉑、5-Fu和紫杉醇的藥物敏感性明顯降低，與同等藥物濃度處理的轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組的 Hela細(xì)胞活性相比，差異具有顯著性（P＜0.05）。結(jié)果提示過表達(dá)Galectin-3的Hela細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力及抗藥性均明顯增加。

9、r>　　（3）通過生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)軟件分析，發(fā)現(xiàn) miR-128可能靶向調(diào)控 Galectin-3的表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在10株結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-128的表達(dá)均明顯低于Galectin-3低表達(dá)的Hela細(xì)胞（P＜0.05），提示miR-128的表達(dá)模式與Galectin-3表達(dá)模式呈負(fù)相關(guān)。初步提示兩者之間可能存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。使用miR-128特異性的minics轉(zhuǎn)染miR-128低表達(dá)的HT-29和SW620細(xì)胞，Wes

10、tern blot和qRT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Galectin-3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在HT-29和SW620細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-128特異性的minics后，mRNA水平和蛋白水平Galectin-3的表達(dá)均顯著低于陰性對(duì)照組，兩者相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示miR-128的表達(dá)上調(diào)可以引起Galectin-3的表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果也證實(shí)miR-128可以通過與Galectin-3基因3

11、’-UTR區(qū)miR-128預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，從而直接負(fù)向調(diào)控Galectin-3的表達(dá)。
　　（4）在結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和SW620中通過轉(zhuǎn)染miR-128特異性minics恢復(fù)其中miR-128的表達(dá)水平。Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的HT-29和SW620細(xì)胞遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目分別為（41.33±0.8819）個(gè)和（107.3±2.028）個(gè)，轉(zhuǎn)染miR-128 minics后HT-29和SW

12、620細(xì)胞遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目分別為（7.333±0.8819）和（28.33±0.8819），明顯少于陰性對(duì)照組，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示 miR-128高表達(dá)可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力。繼而使用不同濃度的順鉑、奧沙利鉑、5-Fu和紫杉醇分別處理轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照和miR-128 minics的HT-29和SW620細(xì)胞，結(jié)果提示：相同濃度的化療藥物處理下，轉(zhuǎn)染miR-128 minics的HT-29和SW6

13、20細(xì)胞的活性顯著低于陰性對(duì)照組，差異具有顯著性（P＜0.05），提示 miR-128過表達(dá)可以增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。
　?。?）在結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和SW620中，轉(zhuǎn)染miR-128 minics引起Galectin-3低表達(dá)后，再分別轉(zhuǎn)染空白載體pLEX/MCS和Galectin-3過表達(dá)載體pLEX/Gal-3，同樣重復(fù) Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染空白載體pLEX/MCS的HT-29和

14、SW620細(xì)胞遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目分別為（8.667±0.8819）個(gè)和（41.33±2.028）個(gè)，而這一數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)染pLEX/Gal-3的HT29和SW620細(xì)胞中分別為（123.0±1.732）個(gè)和（180.7±1.764）個(gè)，前者明顯低于后者，兩者比較差異具有顯著性（P＜0.05）。藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：相同濃度的化療藥物處理分別轉(zhuǎn)染pLEX/MCS和pLEX/Gal-3的HT-29和SW620細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pLEX/Gal-3的HT-29和

15、SW620細(xì)胞的活性明顯高于轉(zhuǎn)染空白載體pLEX/MCS的HT-29和SW620細(xì)胞，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這一結(jié)果再次證實(shí) miR-128是通過直接靶向調(diào)控Galectin-3的表達(dá)發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移以及增強(qiáng)其對(duì)化療藥物敏感性的作用的。
　　結(jié)論：
　　（1） Galectin-3在結(jié)腸癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌組織中普遍高表達(dá)；在結(jié)直腸癌患者中，其高表達(dá)與患者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。