血管活性腸肽對急性肺損傷時肺內(nèi)TREM-1表達的影響及其機制.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury, ALI)及其嚴重形式急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是多種因素引起的臨床常見危重癥，而過度炎癥反應是導致ALI/ARDS的主要原因，因此，抑制ALI/ARDS早期階段的“瀑布式”炎癥反應可改善ALI/ARDS的預后。髓樣細胞表達觸發(fā)受體-1(triggering receptorexpressed on myeloid

2、 cells-1，TREM-1)是表達于巨噬細胞和中粒細胞等髓樣細胞表面的免疫球蛋白超家族受體，研究表明TREM-1可放大TLR4介導的免疫應答和炎癥反應。血管活性腸肽(vasoactive intestinalpeptide，VIP)是肺內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)肽之一。本室前期實驗證實VIP可抑制TNF-α等炎癥因子的表達而呈現(xiàn)出抑炎特性。VIP對ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1表達有無影響尚未見報道。
　　 目的:
　　 觀察

3、脂多糖(LPS)誘導的ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1的表達及VIP的調(diào)控。
　　 方法:
　　 1.采用LPS復制ALI小鼠動物模型，RT-PCR法檢測肺內(nèi)TREM-1mRNA表達;氣管注射VIP慢病毒觀察肺內(nèi)高表達VIP對 ALI時小鼠TREM-1 mRNA表達的影響;
　　 2.給予靜息狀態(tài)的小鼠巨噬細胞不同濃度的VIP和不同的作用時間，RT-PCR法檢測TREM-1 mRNA表達;進一步以LPS應激小鼠巨噬細胞

4、，給予不同濃度的VIP預處理和不同的作用時間，采用RT-PCR法檢測TREM-1 mRNA表達，流式細胞術檢測TREM-1蛋白表達。NF-κB抑制劑PDTC預處理后觀察LPS應激的巨噬細胞TREM-1的表達。VIP預處理后Western Blot檢測LPS應激的小鼠巨噬細胞中I-κB的含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.VIP對ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1 mRNA表達的影響
　　 ALI動物模型復制成功后，采用RT-

5、PCR檢測ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1mRNA的表達，結(jié)果顯示:LPS經(jīng)腹腔注射6h后即可檢測到小鼠肺內(nèi)TREM-1mRNA的表達顯著增加。經(jīng)氣管注射VIP慢病毒觀察肺內(nèi)高表達VIP對ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1 mRNA表達的影響，結(jié)果顯示:與GFP+LPS組相比（0.630±0.039），VIP可降低ALI小鼠肺內(nèi)TREM-1 mRNA的表達（0.531±0.027，P＜0.05）。
　　 2.VIP對LPS應激的小鼠巨噬細胞T

6、REM-1表達的影響
　　 2.1 VIP對靜息狀態(tài)的小鼠巨噬細胞TREM-1 mRNA表達的影響
　　 RT-PCR法檢測結(jié)果顯示:VIP（10-8M）預處理不同時間后(2、4、6、12和24 h)或不同濃度的VIP（10-10、10-9、10-8和10-7 M）預處理后，小鼠巨噬細胞TREM-1 mRNA的表達均無明顯變化（圖3，圖4，P＞0.05）。
　　 2.2VIP對LPS應激的小鼠巨噬細胞TREM-1

7、 mRNA表達的影響RT-PCR檢測顯示:LPS處理3h后即可檢測到小鼠巨噬細胞TREM-1mRNA表達明顯增加(0.062±0.005)，且LPS處理6h后達峰值（0.107±0.015，P＜0.05）。采用不同濃度的LPS(0.04、0.2、1、5和25μg/ml)應激小鼠巨噬細胞，可見隨著LPS濃度升高，小鼠巨噬細胞TREM-1 mRNA表達逐漸增加;當LPS濃度為1μg/ml時，小鼠巨噬細胞TREM-1 mRNA表達最高（0.1

8、65±0.015，P＜0.05）。
　　 RT-PCR檢測顯示:與VIP預處理2 h LPS應激的小鼠巨噬細胞TREM-1 mRNA表達（0.364±0.018）相比，VIP(10-8 M)預處理6h表達明顯減少(0.251±0.008)，VIP預處理12 h表達最低（0.178±0.006），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。采用不同濃度的VIP(10-10、10-9、10-8和10-7 M)預處理LPS應激的小鼠巨噬細胞，

9、可見隨著VIP濃度升高，小鼠巨噬細胞TREM-1 mRNA表達逐漸減少;當VIP濃度為10-7 M時，小鼠巨噬細胞TREM-1 mRNA表達最低（0.249±0.010，P＜0.05）。流式細胞術檢測顯示:LPS（1μg/ml）可增加小鼠巨噬細胞TREM-1蛋白表達(117.46±6.225，P＜0.05)，而VIP(10-8M)可降低TREM-1蛋白表達（90.89±3.635，P＜0.05）。
　　 3.VIP抑制LPS應激

10、的小鼠巨噬細胞NF-κB活化
　　 RT-PCR檢測結(jié)果顯示:PDTC可顯著性地抑制LPS應激的小鼠巨噬細胞TREM-1 mRNA的表達（0.135±0.009，P＜0.05）。進一步采用Western Blot檢測小鼠巨噬細胞中I-κB的含量來反映NF-κB的活化，結(jié)果顯示:VIP對靜息狀態(tài)的小鼠巨噬細胞中I-κB的表達無明顯影響（P＞0.05）;與LPS處理組（0.186±0.022）相比，VIP+LPS組小鼠巨噬細胞I-κ