PIK3CA基因在宮頸病變組織中的表達(dá)及與HPV感染關(guān)系的研究.pdf

1、目的：宮頸癌(cervical cancer)是全球婦女中僅決于乳癌的第二位常見惡性腫瘤。我國(guó)每年新發(fā)病例13.15萬(wàn)，約占全球總數(shù)的三分之一。近年由于人乳頭狀瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染增多，宮頸癌發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)，且患者趨于年輕化。因此，尋找宮頸癌的病因，明確其發(fā)病機(jī)制對(duì)進(jìn)一步預(yù)防、早期診治宮頸癌是十分必要的。 P13K/AKT(phosphoinositide 3-kinase-AK

2、T signalling pathway)信號(hào)傳導(dǎo)通路所介導(dǎo)的脂質(zhì)第二信使在細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。它對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞分化、存活、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等的調(diào)控具有重要作用。其中3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)是由一個(gè)催化亞單位p110α和一個(gè)調(diào)節(jié)亞單位p85所組成，其中p110α就是由PIK3CA基因所編碼。PIK3CA基因，是由34個(gè)堿基對(duì)組成，定位于染色體3q26.3的癌基因，包含20個(gè)

3、外顯子，編碼1068種氨基酸產(chǎn)生124kDa分子量大小的蛋白質(zhì)，編碼3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kina3e，PI3K)的催化亞單位p110α，是上消化道，卵巢，膠質(zhì)細(xì)胞，乳腺等多種腫瘤的癌基因。 近年來國(guó)外關(guān)于宮頸癌染色體改變的研究證實(shí)PIK3CA是宮頸癌的癌基因。國(guó)內(nèi)尚無(wú)有關(guān)PIK3CA基因在宮頸癌方面的研究。本實(shí)驗(yàn)將在mRNA水平上研究宮頸病變組織中PIK3CA基因的表達(dá)情況，并結(jié)合HPV的感染

4、狀態(tài)，探討PIK3CA基因在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，為研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為宮頸癌的預(yù)防、早期診斷、治療及判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。 材料與方法： 一、材料 收集我院1997年5月-2005年5月間收治的宮頸病變患者手術(shù)切除的石蠟標(biāo)本共110例。其中宮頸癌30例，患者年齡25-73歲，平均年齡(62±5.46)歲。均為鱗狀細(xì)胞癌，其中高分化19例，中分化7例，低分化4例，按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO

5、)分期：Ⅰ期：7例，Ⅱ期：14例，Ⅲ期：6例，Ⅳ期：3例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的7例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的23例；宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)60例，其中CINⅢ組30例，患者年齡22-6l歲，平均年齡(53±4.89)歲，CINⅡ/CINⅠ組30例，患者年齡21-59歲，平均年齡(50±4.12)歲；正常宮頸組織(因婦科其它疾病手術(shù)切除的)20例，年齡23-59歲，平均年齡(51±4.98)歲。所有患者術(shù)前均未接受化學(xué)、免疫及放射治療。 二、

6、試劑 PIK3CA mRNA原位雜交檢測(cè)試劑盒；HPV通用型引物;DAB顯色試劑盒；耐熱DNA聚合酶；dd H2O；10×buffer液；dNTP；原位雜交專用PBS緩沖液；蒸餾水；30％H2O2；SSC液；蘇木素；二甲苯；酒精；樹膠等。 三、實(shí)驗(yàn)方法 (一) 原位雜交法檢測(cè)PIK3CA mRNA，按試劑盒說明進(jìn)行。以已知外陰鱗癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替探針作為陰性對(duì)照，每例標(biāo)本常規(guī)進(jìn)行蘇木

7、素染色。 (二) PCR法檢測(cè)HPV DNA，采用已知尖銳濕疣標(biāo)本作為正HPV DNA通用型陽(yáng)性對(duì)照，以雙蒸水代替模版DNA作為陰性對(duì)照。 四、結(jié)果判定 (一)原位雜交結(jié)果：原位雜交PIK3CA mRNA陽(yáng)性的判斷以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。 (二)PCR結(jié)果：PCR法中HPV DNA陽(yáng)性的判定以相應(yīng)片段長(zhǎng)度處出現(xiàn)條帶者為陽(yáng)性。 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 1、PIK3CA mRNA檢測(cè)陽(yáng)性率

8、的組間比較和HPV DNA檢出率的組間比較均采用多樣本卡方檢驗(yàn)； 2、HPV DNA檢出率以及PIK3CA mRNA陽(yáng)性率之間關(guān)系的比較采用一致性檢驗(yàn)，計(jì)算Kappa指數(shù)(KI)，0.75>KI>0.4，定義為一致性良好，KI>0.75為一致性極好； 3、PIK3CA mRNA的表達(dá)和HPV感染分別與宮頸癌組織學(xué)分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等參數(shù)之間關(guān)系的比較采用確切概率法卡方檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、P

9、IK3CA mRNA在宮頸病變組織中的表達(dá)情況 PIK3CA mRNA在宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ/CIN Ⅰ及正常宮頸上皮組中表達(dá)的陽(yáng)性率分別為66.7％、60.0％、16.7％和0.00％。PIK3CA mRNA在宮頸癌和CINⅢ組中的表達(dá)明顯高于CINⅡ/CIN Ⅰ組和正常宮頸上皮組(P<0.01)；宮頸癌組與CINⅢ組之間比較以及CIN Ⅱ/CIN Ⅰ組與正常宮頸上皮組之間比較，PIK3CA mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

10、義(P>0.05)。在宮頸癌組織中PIK3CA mRNA的表達(dá)隨臨床期別的增高、病理分化程度的降低而增高；其中PIK3CA mRNA的表達(dá)在宮頸癌Ⅲ、Ⅳ期組高于Ⅰ期組和Ⅱ期組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ⅱ期組高于Ⅰ期組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中、低分化組高于高分化組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雖然PIK3CA mRNA的表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，但兩組間比較其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0

11、.05)。 二、HPV DNA在宮頸病變組織中的檢出情況 在宮頸癌組、CINⅢ組、CIN Ⅱ/CIN Ⅰ組及正常宮頸上皮組中HPV DNA的檢出率分別為83.3％、66.7％、56.7和0％。其中宮頸癌組與CINⅢ組之間比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，宮頸癌組分別與CIN Ⅱ/CIN Ⅰ組及正常宮頸上皮組比較差異均具有顯著性(P<0.05)；CINⅢ組與CINⅡ/CIN Ⅰ組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，CINⅢ組

12、與正常宮頸上皮組比較差異有顯著性(P<0.01)；CIN Ⅱ/CIN Ⅰ組與正常宮頸上皮組比較差異具有顯著性(P<0.01)；HPV DNA的檢出率在宮頸癌臨床分期各組間分別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在組織學(xué)分化程度各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間比較差異不顯著(P>0.05)。 結(jié)論： 1、PIK3CA基因擴(kuò)增和HPV感染與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。 2、在宮頸病變的