同型半胱氨酸對(duì)培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及鹽酸氟桂利嗪的保護(hù)作用.pdf

1、缺血性腦血管疾病已成為當(dāng)今全球性致殘的重要原因之一。目前確定的缺血性腦血管疾病的危險(xiǎn)因素主要包括高齡、血脂異常、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖癥。大量的臨床試驗(yàn)及流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)血漿同型半胱氨酸水平升高是缺血性腦血管疾病的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。Hcy促進(jìn)低密度脂蛋白的氧化，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)血栓素A2的生成和血小板聚集、凝血因子V的活化等多方面機(jī)制引起血管損傷。有研究[1]認(rèn)為，輕、中度

2、tHcy濃度增高與中風(fēng)的發(fā)生密切相關(guān)。盡管補(bǔ)充葉酸、維生素B6和B12等治療能降低血漿同型半胱氨酸的水平，但是否能降低缺血性腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)仍有待于大量的動(dòng)物研究及臨床試驗(yàn)。有研究顯示[2]：降低同型半胱氨酸濃度不能預(yù)防卒中復(fù)發(fā)。尋找其他的治療方法逐漸受到人們的重視。內(nèi)皮細(xì)胞(EC)是襯貼于血管內(nèi)面的單層扁平細(xì)胞，是血液和組織之間的第一道屏障，對(duì)血管平滑肌起保護(hù)作用，對(duì)維持正常的組織結(jié)構(gòu)和功能起著十分重要的作用，同時(shí)它也是眾多損傷因素發(fā)

3、揮作用的始發(fā)部位。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能障礙將啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。我們的實(shí)驗(yàn)以正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV-304)為模型，觀察同型半胱氨酸的損傷及鹽酸氟桂利嗪保護(hù)作用，期望能為治療高Hcy血癥探索另一條新的途徑。 目的：①通過培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞，研究不同濃度的Hcy對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；②觀察鹽酸氟桂利嗪干預(yù)后的ECV-304細(xì)胞是否能夠降低Hcy的細(xì)胞毒作用；③探討Hcy對(duì)ECV-304細(xì)胞游離鈣離子濃度及黏附分子的

4、表達(dá)的影響及鹽酸氟桂利嗪的拮抗作用。 方法：①實(shí)驗(yàn)一：培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞，傳至第四代后，分成7組，將其與不同濃度的Hcy(0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L)和鹽酸氟桂利嗪(10μmol/L)共同培養(yǎng)20小時(shí)，分別利用MTT、流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察ECV-304細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；②實(shí)驗(yàn)二：分組同實(shí)驗(yàn)一，3利用Ca2+指示劑Flu-3AM作為細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光探針負(fù)載培養(yǎng)E

5、CV-304，共聚焦技術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照組、Hcy組，鹽酸氟桂利嗪干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化。③實(shí)驗(yàn)三：分組同實(shí)驗(yàn)一，用ELISA法檢測(cè)Hcy組及鹽酸氟桂利嗪干預(yù)組ECV-304細(xì)胞sICAM-1及sVCAM-1的光密度值。 結(jié)果：①ECV-304細(xì)胞與不同濃度的Hcy培養(yǎng)20小時(shí)后，細(xì)胞光吸收值呈現(xiàn)劑量依賴性的降低(Hcy≥200umol/L，P＜0.05)，分別從正常對(duì)照組的0.177±0.011降至0.156±0.009(

6、Hcy200μmol/L)，0.148±0.010(Hcy500μmol/L)，0.134±0.007(Hcy1000μmol/L)；滯留于G1期的細(xì)胞比例增加，從正常對(duì)照組的43.5％增至45.3％(Hcy100μmol/L)，48.2％(Hcy200μmol/L)，49.5％(Hcy500μmol/L)，53.2％(Hcy1000μmol/L)，而S期的細(xì)胞比例減少，從正常對(duì)照組的48.3％降至42.3％(Hcy100μmol/L)

7、，41.2％(Hcy200μmol/L)，41.3％(Hcy500μmol/L)，37.6％(Hcy1000μmol/L)，加入鹽酸氟桂利嗪干預(yù)后，細(xì)胞光吸收值明顯提高(P＜0.05)，G1期的細(xì)胞比例降低，而S期細(xì)胞比例增加。②隨同型半胱氨酸濃度增加，反映細(xì)胞質(zhì)中[Ca2+]i的相對(duì)熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)(P＜0.01)，從正常對(duì)照組的19.8±1.3增至35.4±3.5(Hcy100μmol/L)，49.2±3.0(Hcy200μmol

8、/L)，60.0±7.5(Hcy500μmol/L)，113.±8.8(Hcy1000μmol/L)，而鹽酸氟桂利嗪干預(yù)后可明顯降低Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(P＜0.01)。③sICAM-1的檢測(cè)結(jié)果：隨Hcy濃度增加，ECV-304細(xì)胞中sICAM-1表達(dá)逐漸增加，從正常對(duì)照組的19.8±1.3增至35.4±3.5(Hcy100μmol/L)，49.2±3.0(Hcy200μmol/L)，60.0±7.5(Hcy500μmol/L

9、)，113.±8.8(Hcy1000μmol/L)，具有顯著性差異(P＜0.01)；加入鹽酸氟桂利嗪干預(yù)后，與相同濃度的Hcy組相比，sICAM-1表達(dá)明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，但Hcy濃度為1000μmol/L時(shí)，降低不顯著(P＞0.05)。sVCAM-1的檢測(cè)結(jié)果：隨Hcy濃度增加，ECV-304細(xì)胞中sVCAM-1表達(dá)逐漸增加，具有顯著性差異(P＜0.01)；加入鹽酸氟桂利嗪干預(yù)后，sVCAM-1表達(dá)明顯降低(P＜0

10、.05，P＜0.01)。但Hcy濃度為4100μmol/L時(shí)，降低不顯著(P＞0.05)。 結(jié)論：①通過細(xì)胞模型說明高濃度的Hcy能夠損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。②鹽酸氟桂利嗪對(duì)Hcy誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞損傷有明顯保護(hù)作用③Hcy可誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度及黏附分子表達(dá)上調(diào)，鹽酸氟桂利嗪可抑制細(xì)胞外鈣內(nèi)流、降低胞內(nèi)游離鈣離子濃度及下調(diào)黏附分子表達(dá)，可能為其保護(hù)作用機(jī)制之一。本項(xiàng)研究的結(jié)果為下一步