Stathmin基因RNA干擾表達載體構建及對骨肉瘤LM8細胞系相關生物學行為影響的實驗研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：Stathmin siRNA表達載體構建及干擾效果鑒定
　　 背景與目的：RNAi是轉錄后基因沉默，其作為一種高效的基因敲除工具，能有效調(diào)節(jié)有機體和細胞特定基因的表達，其為人類腫瘤的基因治療提供了廣闊的臨床應用前景。構建stathmin基因RNA干擾真核表達質(zhì)粒載體，并觀察其轉染C3h鼠源性骨肉瘤LM8細胞系前后stathmin基因表達的變化。
　　 方法：根據(jù)GenBank中

2、stathmin（小鼠）序列，設計針對stathmin基因編碼區(qū)的寡核苷酸鏈，體外退火后克隆入經(jīng)BamHⅠ、Hind Ⅲ 雙酶切線性化的干擾質(zhì)粒載體pGenesiL-1中，對重組質(zhì)粒進行酶切分析和DNA序列測定。以脂質(zhì)體法將3個重組質(zhì)粒（pGenesiL-1-stathmin1、pGenesiL-1-stathmin2和pGenesiL-1-HK）分別轉染C3h鼠源性骨肉瘤LM8細胞系。細胞轉染后G418篩選獲得穩(wěn)定的細胞系。研究的細胞

3、分5組：C1組LM8細胞空白對照(命名LM8空白)；C2組LM8細胞+脂質(zhì)體(命名LM8脂質(zhì)體)；C3組轉染非特異性的siRNA HK質(zhì)粒(命名pGenesiL-1-HK);C4轉染特異性的siRNA stathmin1質(zhì)粒(命名pGenesiL-1-stathmin1)；C5組轉染特異性的siRNA stathmin2質(zhì)粒(命名pGenesiL-1-stathmin2)。然后實時熒光定量PCR檢測各組LM8細胞系stathmin Mr

4、na的表達，Western blotting 技術檢測stathmin基因在蛋白水平的表達。
　　 結果：經(jīng)酶切鑒定及DNA 測序，重組質(zhì)粒中成功插入了目的基因片斷。pGenesiL-1-stathmin1和pGenesiL-1-stathmin 2轉染C3h鼠源性骨肉瘤LM8細胞系后，均明顯抑制了stathmin Mrna 及其蛋白的表達。
　　 結論：成功構建了針對stathmin RNA干擾質(zhì)粒表達載體pGenes

5、iL-1-stathmin1和pGenesiL-1-stathmin2，它們均能有效抑制stathmin基因在骨肉瘤LM8細胞系的表達。這為stathmin基因應用于骨肉瘤的治療研究奠定了理論基礎。
　　 第二部分：Stathmin-siRNA對骨肉瘤LM8細胞系相關生物學行為的影響
　　 背景與目的：Stathmin在多種惡性腫瘤細胞中都有高水平表達，通過抑制其表達可以明顯干擾惡性腫瘤細胞的分裂，影響腫瘤細胞的增殖與凋

6、亡。本研究觀察已構建的靶向stathmin基因RNA干擾質(zhì)粒表達載體轉染LM8細胞系后對細胞生物學行為的影響。
　　 方法：將已構建的靶向stathmin干擾質(zhì)粒pGenesiL-1-stathmin和通用對照質(zhì)粒pGenesiL-1-HK，以脂質(zhì)體法將2個重組質(zhì)粒分別轉染骨肉瘤LM8細胞系。臺盼藍染色法測定觀察細胞的生長，MTT(噻唑藍)法比色分析檢測細胞體外生長抑制率；軟瓊脂集落形成實驗觀察單個細胞體外增殖活力；細胞HE染色

7、觀察細胞形態(tài)學的變化；Hoechst染色觀察細胞凋亡特征并計算凋亡率；流式細胞術定量分析細胞周期的變化；C3H小鼠移植瘤實驗顯示腫瘤細胞的成瘤能力。
　　 結果：成功構建的pGenesiL-1-stathmin重組質(zhì)粒轉染LM8細胞后，明顯抑制了細胞的體外生長，細胞體外生長抑制率顯著增加；單個細胞體外增殖活力顯著下降；細胞HE染色部分細胞呈典型的凋亡細胞形態(tài)學改變；Hoechst染色顯示細胞凋亡特征，細胞凋亡率明顯增高；流式細胞

8、術檢測顯示細胞周期阻滯于G2/M期,比率明顯增高；C3H小鼠移植瘤實驗顯示特異轉染組腫瘤細胞致瘤率下降，腫瘤生長減緩。
　　 結論：成功構建的靶向干擾質(zhì)粒pGenesiL-1-stathmin能明顯影響骨肉瘤LM8細胞的相關生物學行為。其有效抑制骨肉瘤細胞的增殖與生長，這為把stathmin基因應用于骨肉瘤的基因治療研究奠定了理論基礎。
　　 第三部分：Stathmin基因沉默協(xié)同增效泰索帝對骨肉瘤細胞化療作用的實驗研究

9、
　　 背景與目的: Stathmin蛋白是至關重要的細胞周期調(diào)控因子，其促進微管解聚，阻斷細胞有絲分裂紡錘體形成從而調(diào)節(jié)細胞的增殖。泰索帝抗腫瘤化療藥是通過促進微管聚合，從而導致紡錘體功能障礙及細胞的凋亡。本研究探討stathmin基因沉默協(xié)同增效泰索帝對骨肉瘤細胞的化療敏感性。
　　 方法：將已構建成功的針對stathmin Mrna的siRNA真核質(zhì)粒轉染LM8骨肉瘤細胞并獲得穩(wěn)定的細胞系。泰索帝和順鉑分別誘導對照

10、組LM8細胞﹑轉染的LM8細胞，臺盼藍染色法測定以上二組細胞的生長，軟瓊脂集落形成實驗觀察二組細胞的單個細胞體外增殖活力，MTT(噻唑藍)法分別檢測泰索帝和順鉑對二組細胞的半數(shù)抑制濃度，流式細胞術定量分析泰索帝對二組細胞周期及細胞凋亡率的影響。
　　 結果：與對照組相比，不同濃度的泰索帝和順鉑均抑制了LM8細胞的生長，但泰索帝對轉染的LM8細胞生長抑制作用尤為明顯；泰索帝較順鉑更加明顯減少了單個細胞，特別是轉染LM8骨肉瘤細胞體