繁縷抗乙肝病毒物質(zhì)基礎(chǔ)組分結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、繁縷(Stellaria media(L.)Villar.)為石竹科(Caryophyllaceae)繁縷屬(Stellaria L.)一年或二年生草本植物。繁縷分布于全國(guó)各省區(qū)，為歐、亞廣布種，常生于水邊，溝邊及湖洲岸緣或土埂旁草叢中，野生資源十分豐富，具有開(kāi)發(fā)利用潛質(zhì)。繁縷歸肝、大腸經(jīng)，味微苦、甘、酸，性涼；以全草入藥，富含多糖、黃酮、環(huán)肽、酚酸等多種化學(xué)成分，具有明顯的抗炎和抗病毒作用。近年來(lái)，繁縷抗病毒的研究成為科研領(lǐng)域的熱點(diǎn)，

2、本課題研究在中藥“組分結(jié)構(gòu)”理論的指導(dǎo)下，以HepG2.2.15細(xì)胞為藥效模型，篩選繁縷體外抗.乙肝病毒的活性部位；采用現(xiàn)代分離純化技術(shù)，對(duì)繁縷中有效組分及成分進(jìn)行分析，并結(jié)合藥理試驗(yàn)，進(jìn)一步解析繁縷抗乙肝病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　本文首先對(duì)抗乙型肝炎病毒的天然產(chǎn)物研究概況作己概述，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，總結(jié)了繁縷屬化學(xué)成分與抗病毒的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)部分主要進(jìn)行了以下研究：
　　1.繁縷抗乙肝病毒活性部位的篩選
　　采用鮮

3、藥繁縷榨汁，由鮮榨汁液制備7種不同方式處理的樣品，以HepG2.2.15細(xì)胞為乙肝病毒體外細(xì)胞模型，HBsAg、HBeAg和HBV DNA為檢測(cè)指標(biāo)，篩選繁縷抗乙肝病毒的活性部位，結(jié)果表明繁縷大于5K部位具有較佳的抗乙肝病毒的效果。采用定性的方法進(jìn)行化學(xué)成分預(yù)試，可知繁縷大于5K部位含有多糖、蛋白和黃酮組分，為下一步詳細(xì)分析其抗乙肝病毒物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論依據(jù)。
　　2.繁縷抗乙肝病毒組分間結(jié)構(gòu)分析
　　有效組分群是指多種有效

4、組分的組合，多組分共同作用可達(dá)到最佳的藥效結(jié)果。有效組分群的研究，即解析繁縷抗乙肝病毒組分間的結(jié)構(gòu)關(guān)系，實(shí)驗(yàn)以繁縷大于5K部位為研究對(duì)象，對(duì)其所含有的有效組分進(jìn)行研究。采用紫外分光光度法對(duì)繁縷大于5K部位的總黃酮、總糖和蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定，可知三者的含量比為1:11.9：16.7。
　　繁縷大于5K部位凍干粉溶解離心，上清液上樣HP20大孔吸附樹(shù)脂分為水部位和醇部位：水部位主要含有蛋白和糖類的大分子化合物，醇部位主要為多酚類的小分

5、子化合物。大孔樹(shù)脂的水部位和醇部位按同等生藥量混合(D)，與繁縷大于5K部位(A)、大孔樹(shù)脂水部位(B)和醇部位(C)進(jìn)行抗乙肝病毒的藥效考察，首先，從抗原角度分析，A和D對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率均高于B和C，且兩者之間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著性差異(p>0.05)，其抑制率僅次于陽(yáng)性藥3TC。其次，從HBV DNA角度分析，A、D和3TC的HBV DNA含量與正常組具有顯著性差異(p<0.05)。由此可知，繁縷大于5K部位是其抗乙肝病

6、毒的有效組分群，大孔樹(shù)脂不會(huì)吸附其有效成分，多糖、蛋白等大分子物質(zhì)與黃酮等小分子化合物共同作用可發(fā)揮最佳的抗乙肝病毒的作用(以大分子物質(zhì)占主導(dǎo)作用)，符合“組分結(jié)構(gòu)”理論的思想，繁縷抗乙肝病毒是多組分共同作用的結(jié)果。
　　3.繁縷抗乙肝病毒多糖組分和黃酮組分內(nèi)部結(jié)構(gòu)分析
　　(1)經(jīng)脫色、脫蛋白、DEAE-52和Sephadex G100處理，對(duì)多糖組分進(jìn)行分離純化，得到5種純度較高的均一化多糖(SMP-1～SMP-5)，并

7、進(jìn)行了初級(jí)結(jié)構(gòu)解析。
　　首先，運(yùn)用高效凝膠滲透色譜測(cè)定5種繁縷多糖的分子量及其分布，5種繁縷多糖分子量分布在9000～25000之間，分子量分布系數(shù)均小于2，說(shuō)明5種繁縷多糖皆為均一性多糖；多糖的含量測(cè)定表明，5種繁縷多糖中除SMP-1的含量較低(26％)，其他四種繁縷多糖的多糖含量均在48％以上。
　　其次，多糖中單糖組成是多糖結(jié)構(gòu)解析中重要的一步。5種繁縷多糖經(jīng)三氟乙酸水解，乙?；螅捎肎C法分析其單糖組成及摩爾比，

8、可知SMP-1～SMP-3均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其摩爾比分別為鼠李糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖=(2.44:3.70:1.00:9.78:3.70：11.56)，(4.74:4.88:1.00:18.60:9.42:25.51)，(10.61:8.10:3.19:1.00:15.55：22.21)；SMP-4和SMP-5則均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其摩爾比分別為鼠李

9、糖：阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖=(1.73:1.00：1.59:3.71:3.00)，(5.41:26.30:2.06:1.00:36.73)。
　　最后，結(jié)合體外細(xì)胞模型，分析純化多糖及5種繁縷多糖按同等生藥量混合的組合物的抗乙肝病毒效果，5種繁縷多糖對(duì)HBsAg和HBeAg抑制率均較低(10％)，繁縷組合物對(duì)乙肝病毒具有一定的抑制作用，200μg/mL濃度下在第9 d對(duì)乙肝病毒HBsAg和HBeAg抑制率分別達(dá)到26.5

10、6％和30.25％，與陽(yáng)性藥3TC相比無(wú)顯著性差異(p>0.05)。
　　(2)繁縷大于5K部位含有黃酮類成分(黃酮組分)，由高效液相色譜進(jìn)行化學(xué)成分表征可知，主要為黃酮碳苷類化合物，且繁縷大于5K部位經(jīng)大孔樹(shù)脂分離富集，各部位液相圖譜表明其所含化學(xué)成分相似，證實(shí)該部位小分子化合物主要為黃酮碳苷。采用LC-MS對(duì)繁縷大于5K部位中的黃酮成分進(jìn)行定性分析，由分析結(jié)果可知，該部位含有兩類黃酮碳苷成分，一類是分子離子峰[M+1]為594

11、，是以芹菜素為母核，連接兩個(gè)六碳糖的黃酮碳苷類；一個(gè)是分子離子峰[M+1]為564，是以芹菜素為母核，連接一個(gè)五碳糖和一個(gè)六碳糖的黃酮碳苷類。通過(guò)LC-MS的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)繁縷大于5K部位含有牡荊素，其裂解規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道相符。
　　綜上所述，繁縷具有一定的抗乙肝病毒的作用，該工作至今未見(jiàn)報(bào)道。繁縷大于5K部位是其抗乙肝病毒的有效組分群，該組分群是由多糖組分、黃酮組分和蛋白組分共同組成。其中多糖組分中首次分離純化得到5種繁

12、縷精制多糖，分子量分布在9000～25000之間的均一性多糖，5種繁縷多糖按一定的比例混合均勻獲得繁縷多糖組合物，該組合物具有明顯的抗乙肝病毒活性，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道；黃酮組分對(duì)乙肝病毒的抑制作用較弱，本課題借助HPLC和LC-MS對(duì)繁縷大于5K部位的黃酮成分進(jìn)行了定性分析，由此對(duì)繁縷中的黃酮成分有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)；由于時(shí)間問(wèn)題，蛋白組分沒(méi)有進(jìn)行深入的分析研究，其是否影響繁縷抗乙肝病毒的活性還需更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)證實(shí)。
　　本文借助體外