pEGFP-AFP-TK的構(gòu)建及經(jīng)PEG-PEI-Fe-,3-O-,4-納米磁流體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：本課題是構(gòu)建AFP啟動(dòng)子介導(dǎo)的HSV/TK重組真核表達(dá)載體、并研究其對(duì)AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞株的特異性表達(dá)作用。同時(shí)研究PEG-PEI/Fe3O4納米磁流體作為肝癌的基因治療載體的可行性。 方法：PCR擴(kuò)增AFP基因啟動(dòng)子、HSV-TK基因，將上述片斷插入EGFP-N1載體的多克隆位點(diǎn)，從而構(gòu)建甲胎蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下HSV-TK基因重組表達(dá)載體pEGFP-AFP-TK，通過包裹PEG-PEI/Fe3O4納米磁流體，經(jīng)其介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染

2、AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞株HepG2和AFP陰性肝癌細(xì)胞株SMMC7721，利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白及Western b1ot法檢測(cè)目的基因在2種細(xì)胞系中的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上測(cè)定不同DNA/基因載體的最佳轉(zhuǎn)染效率，取最佳轉(zhuǎn)染效率的DNA/基因載體的復(fù)合物比例進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，做流式細(xì)胞檢測(cè)比較不同基因轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染效率。用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的存活率，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果：經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到TK基因、AFP啟動(dòng)子基因片段，再進(jìn)行連接。長(zhǎng)

3、度分別為247bp、1159bp、1381bp，與預(yù)期大小一致。并將其連接于EGFP-N1載體送上海吉?jiǎng)P基因公司測(cè)序，結(jié)果正確。AFP啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)下游基因在AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞株中特異表達(dá)。而在AFP陰性肝癌細(xì)胞株中不表達(dá)。PEG-PEI/Fe3O4納米磁流體轉(zhuǎn)染率高于脂質(zhì)體。TK自殺基因?qū)Ω伟┘?xì)胞HEPG2的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。 結(jié)論：肝癌特異性真核表達(dá)載體pEGFP-AFP-TK構(gòu)建成功。利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白及Weste