L-Arg對致死型約氏瘧原蟲感染BALB-c小鼠免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的研究.pdf

1、瘧疾是山瘧原蟲感染引起的嚴(yán)重威脅人類生命的感染性疾病之一。最新的統(tǒng)計顯示，全世界每年有2-3億瘧疾感染病例，病死人數(shù)高達(dá)100萬。動物模型和人體研究的結(jié)果均已表明：CD4+T細(xì)胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在瘧疾感染過程中，以IFN-γ分泌增加為主的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答可顯著遏制原蟲的爆發(fā)性增殖，因此誘導(dǎo)有效的抗瘧免疫十分重要。
　　 L-Arg在人類中已經(jīng)被安全使用了十幾年了，在成人中是非必須氨基酸，而在

2、兒童中是必須氨基酸。L-Arg能夠發(fā)揮抗腫瘤、促進(jìn)傷口愈合和增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答等多種功能。在瘧疾中，有限的研究表明瘧疾感染患者L-Arg水平明顯降低，坦桑尼亞兒童血漿低L-Arg明顯和腦瘧的病死率呈負(fù)相關(guān)，低L-Arg導(dǎo)致腦瘧兒章NO產(chǎn)生限制，發(fā)生嚴(yán)重的瘧疾。L-Arg能夠恢復(fù)印度尼西亞患有嚴(yán)重瘧疾的成人內(nèi)皮功能以及促進(jìn)NO的產(chǎn)生。然而，目前關(guān)于L-Arg在瘧疾感染免疫中對免疫應(yīng)答的作用機(jī)制尚不清楚。
　　 我們前期

3、已經(jīng)成功建立的瘧原蟲易感的鼠瘧模型，實驗結(jié)果顯示：在致死型約氏瘧原蟲（Plasmosiumyoelii，P.y17XL）感染過程中，BALB/c小鼠由于難以建立有效的Th1應(yīng)答而全部死于感染早期。為此，擬利用我們成功建立的P.y17XL易感鼠瘧模型，觀察L-Arg對P.y17XL易感鼠的Th應(yīng)答影響，以期探討L-Arg在P.y17XL感染中的作用及其相關(guān)機(jī)制。旨在為瘧疾的有效控制揭示新的理論依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　

4、 1、實驗動物、瘧原蟲及主要試劑
　　 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供（許可證編號：SCXK京200420001）；P.y17XL（日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈）；L-Arg購自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。
　　 2、動物分組與L-Arg處理
　　 BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組：對照組和L-Arg組，每組20只小鼠。P.y17XL感染前1.5g/Kg

5、體重灌胃生理鹽水或L-Arg。體外實驗：提取感染后第3d小鼠的脾細(xì)胞，與L-Arg共培養(yǎng)，L-Arg終濃度為0、100和400μmol/L，在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h后收集細(xì)胞，用于流式檢測。
　　 3、實驗動物感染
　　 BALB/c小鼠分別經(jīng)腹腔感染1×106P．y17XL寄生的紅細(xì)胞，感染不同時間小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數(shù)紅細(xì)胞感染率，并每同觀察生存率。
　　 4

6、、脾細(xì)胞培養(yǎng)
　　 小鼠感染0d、3d和5d常規(guī)無菌摘取脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液。用含10％FCS的RPM11640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度至1×107個/ml，24孔培養(yǎng)板(FALCON)，每孔加入500μ1細(xì)胞懸液，一式3孔，培養(yǎng)48h。350×g室溫離心10min，收集上清，-80℃保存，待細(xì)胞因子及NO測定。
　　 5、細(xì)胞因子檢測
　　 雙抗體夾心ELISA法對小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-10和TN

7、F-α的含量分別進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀(InterMedNJ-2100)測定450nm處OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 6、NO水平檢測
　　 Griess試劑檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量，100μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液和100μlGriess反應(yīng)液室溫反應(yīng)10min，酶標(biāo)儀檢測550nm處OD值，以NaNO2作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行濃度換算。
　　 7、流式細(xì)胞儀檢測小鼠脾臟細(xì)胞
　　 (1)體

8、內(nèi)：FACS檢測小鼠感染0d、3d和5d脾細(xì)胞中mDCs、pDCs、CD11c+CD86+DCs、CD11c+MHCⅡ+DCs、CD11c+CD40+DCs、CD11c+CD80+DCs、CD4+CD69+T、F4/80+CD36+巨噬細(xì)胞百分?jǐn)?shù)；
　　 (2)體外：小鼠感染3d脾細(xì)胞和L-Arg共培養(yǎng)后，F(xiàn)ACS檢測mDCs、pDCs、CD11c+CD86+DCs、CD11c+MHCⅡ+DCs、CD11c+TLR9+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)

9、。
　　 8、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，標(biāo)本采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、小鼠不同時間原蟲血癥及其生存率
　　 對照組小鼠感染后3d原蟲血癥水平開始迅速上升，小鼠于感染后第6d-8d全部死亡。與此相比，L-Arg組小鼠原蟲血癥上升緩慢，在感染第16d小鼠全部死亡。L-Arg明顯的降低了原蟲血癥水平，延長了生存期。
　　

10、 2、小鼠感染早期不同時間Th1免疫應(yīng)答水平
　　 在感染后第3d和5d，L-Arg組小鼠CD4+CD69+T細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)有意義的升高；脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α水平均比對照組小鼠高；F4/80+CD36+巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯的增加；但是F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量沒有變化；L-Arg還促進(jìn)了NO水平出現(xiàn)有意義的增加。
　　 3、小鼠感染早期不同時間DCs的變化
　　 小鼠感染不同時間不論是mDCs還是pDC

11、s于感染后第3d和5d均出現(xiàn)有意義的升高。DCs表面分子CD86和共刺激分子MHCⅡ的表達(dá)都出現(xiàn)明顯增加，但是CD40和CD80沒有變化。另外，更加有意義的是，L-Arg明顯的促進(jìn)了DCs胞內(nèi)TLR9的表達(dá)。體外L-Arg刺激脾細(xì)胞中mDCs和pDCs數(shù)量增加，促進(jìn)MHCⅡ、CD86和TLR9的表達(dá)。
　　 4、小鼠感染早期不同時間Treg以及IL-10的動態(tài)變化
　　 正常感染小鼠Treg數(shù)量在感染后出現(xiàn)明顯的升高，但