下調(diào)Ape1-Ref-1在Genistein防護(hù)放射性肺損傷和PDT對(duì)非小細(xì)胞肺癌殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、放射性肺損傷(Radiation-inducedlunginjury,RILI)是戰(zhàn)時(shí)或平時(shí)如核武器損傷、核輻射事故、造血干細(xì)胞移植預(yù)處理以及胸部腫瘤放療的常見嚴(yán)重并發(fā)癥,且目前的臨床救治措施并不能有效預(yù)防或轉(zhuǎn)歸放射性肺炎及進(jìn)一步的纖維化,病死率極高。制約放射性肺損傷治療的關(guān)鍵問題一個(gè)是DNA氧化損傷,一個(gè)是含氧中間產(chǎn)物活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)驅(qū)動(dòng)氧化應(yīng)激、啟動(dòng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞產(chǎn)

2、生的炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)。對(duì)于DNA氧化損傷,電離輻射的生物學(xué)研究表明,細(xì)胞DNA是電離輻射(IR)最為主要的靶分子,IR可通過(guò)直接電離和ROS間接作用致細(xì)胞嘌呤和嘧啶堿基氧化、堿基缺失(AP位點(diǎn))以及單鏈斷裂進(jìn)而形成雙鏈斷裂,人體細(xì)胞乃至所有生物細(xì)胞都存在著核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)和錯(cuò)配修復(fù)等四個(gè)較為完善的DNA修復(fù)通路,這是細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定和完整的一種基本防御及保護(hù)機(jī)制。目前的研究表明,脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(a

3、purinic/apyrimidinicendonuclease1,APE1)又稱為氧化還原因子(redoxfactor-1,Ref-1),它不僅是DNA堿基切除修復(fù)途徑的主要限速酶,還是一種能通過(guò)調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子氧化還原狀態(tài),對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有防御作用的保護(hù)基因。已有研究提示輻射誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)可能在調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生非靶向性效應(yīng),從而在介導(dǎo)和放大放射性肺損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用,針對(duì)抑制NF-κB活性

4、的研究將可能為開發(fā)放射性肺損傷特殊的治療方法提供一個(gè)平臺(tái)。多酚類小分子化合物三羥基異黃酮具有下調(diào)輻射所致Ape1/Ref-1表達(dá)增加從而抑制NF-κBDNA結(jié)合活性功能。但目前關(guān)于Ape1/Ref-1蛋白在放射性肺損傷的表達(dá)特點(diǎn)、規(guī)律及作用機(jī)制尚不清楚,也無(wú)明確有效的RILI防治措施,嚴(yán)重制約著放射性肺損傷的防治,研究闡明這些問題對(duì)提高放射性肺損傷的救治水平有非常重要的意義。
　　研究目的:
　　1.研究三羥異黃酮(geni

5、stein,GEN)下調(diào)Ape1/Ref-1的表達(dá)對(duì)放射性肺損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制,為防治放射性肺損傷提供理論依據(jù)。
　　2.研究Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)合血卟啉衍生物(hematoporphrphyrinderivative,HpD)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法(photodynamictherapy,PDT)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的殺傷作用及其分子機(jī)制,進(jìn)一步驗(yàn)證在放射性肺損傷防護(hù)中Ape1/Ref-1-NF-κ

6、B的作用途徑,理論上進(jìn)一步豐富我們對(duì)Ape1/Ref-1分子生物功能的認(rèn)識(shí)。
　　研究?jī)?nèi)容和方法:
　　1.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒的構(gòu)建、擴(kuò)增;
　　2.三羥異黃酮防護(hù)放射性肺損傷的效應(yīng)觀察:建立三羥異黃酮及氨磷汀防護(hù)放射性肺損傷小鼠模型(與對(duì)照組比較):不同時(shí)間給予三羥異黃酮及氨磷汀,檢測(cè)組織病理形態(tài)、肺組織羥脯氨酸含量;應(yīng)用液相芯片法、雙抗體夾心法、ROS特異性熒光探針技術(shù)檢測(cè)血清、肺泡灌洗液

7、中炎性細(xì)胞因子(IL-1、TNF-α、IL-6、TGFβ1)/炎性細(xì)胞數(shù)和胞內(nèi)ROS含量的改變;以明確三羥異黃酮的防護(hù)效應(yīng)、給藥時(shí)機(jī)、量效和時(shí)效關(guān)系,為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備;
　　3.三羥異黃酮防護(hù)放射性肺損傷靶細(xì)胞(肺泡II型上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)的機(jī)制探討:應(yīng)用對(duì)照研究,采用Westernblot法及EMSA等技術(shù)檢測(cè)三羥異黃酮下調(diào)輻射所致Ape1/Ref-1表達(dá)增加;三羥基異黃酮下調(diào)Ape1/Ref-1表達(dá)對(duì)NF-κB活性的影響;

8、
　　4.調(diào)控Ape1/Ref-1對(duì)協(xié)同效應(yīng)的影響及可能機(jī)制:應(yīng)用外源性干預(yù)(Ape1/Ref-1RNAi轉(zhuǎn)染)對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制影響;Westernblot法及EMSA法分別檢測(cè)APE1蛋白的表達(dá)及NF-κB活性影響來(lái)驗(yàn)證下調(diào)Ape1/Ref-1與NF-κB的協(xié)同效應(yīng)及可能機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1.三羥異黃酮防護(hù)放射性肺損傷的效應(yīng)觀察:病理檢測(cè)顯示照射后時(shí)間越長(zhǎng),放射性肺損傷小鼠肺纖維化越重,三羥異黃酮能減

9、輕肺組織炎癥及纖維化;照射后小鼠血清及肺泡灌洗液中TGF-β1、IL-6、IL-1和TNF-α等炎性因子和肺組織羥脯氨酸的含量也呈遞增趨勢(shì),三羥異黃酮能降低各種炎性因子和羥脯氨酸的含量(P<0.05),尤其是照射前24h給予三羥異黃酮能達(dá)到與照射前30分鐘給予氨磷汀類似的療效。
　　2.三羥異黃酮防護(hù)放射性肺損傷的機(jī)制探討:經(jīng)射線照射后,A549細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高,三羥異黃酮能明顯降低胞內(nèi)ROS的表達(dá);三羥異黃酮能下調(diào)放療所

10、致的APE1蛋白及NF-ΚB表達(dá)的升高(P<0.05)。
　　3.驗(yàn)證調(diào)控Ape1/Ref-1對(duì)NF-κB協(xié)同效應(yīng)的影響:HpD-PDT作用后,A549細(xì)胞增殖受抑、凋亡增加顯著高于對(duì)照組(P<0.05),其抑制效率依賴于HPD濃度及激光劑量,同時(shí)Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)合PDT對(duì)A549細(xì)胞具有更明顯的增殖抑制作用,胞內(nèi)ROS含量及炎性因子的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。HpD-PDT誘導(dǎo)A549細(xì)胞APE1蛋白表達(dá)

11、增強(qiáng)在24h達(dá)到高峰,10MOIAd5/F35-APE1siRNA重組腺病毒感染A549細(xì)胞48小時(shí)抑制APE1表達(dá)最為顯著。
　　結(jié)論:
　　1.放射性肺損傷小鼠模型研究顯示,輻射誘導(dǎo)肺組織核蛋白APE1/Ref-1表達(dá)顯著增高,呈現(xiàn)由胞核向胞漿移位并先增高后降低特征;輻射誘導(dǎo)APE1/Ref-1表達(dá)增加和異位表達(dá),可通過(guò)其DNA損傷修復(fù)和/或氧化還原功能影響放射性肺損傷修復(fù)。
　　2.APE1/Ref-1是炎性因子

12、的調(diào)控因子,血清/肺泡灌洗液TGF-β1、IL-6、IL-1β和TNF-α含量是放射性肺損傷的預(yù)測(cè)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)為預(yù)測(cè)放射性肺損傷的發(fā)生提供了生物學(xué)預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　3.三羥異黃酮調(diào)控APE1/Ref-1表達(dá)防護(hù)放射性肺損傷的重要作用并闡明了其調(diào)控機(jī)制。三羥異黃酮可顯著減輕放射性肺損傷小鼠肺泡腔內(nèi)炎性滲出以及肺組織羥脯氨酸含量和膠原纖維沉積,其作用機(jī)制與其降低APE1/Ref-1及NF-ΚB表達(dá)從而減輕炎性因子分泌有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)為放

13、射性肺損傷的防治提供了新的手段和方法。
　　4.三羥異黃酮對(duì)防護(hù)放射性肺損傷具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。對(duì)于肺部腫瘤放射治療,三羥異黃酮在下調(diào)Ape1/Ref-1表達(dá)防護(hù)RILI的同時(shí),尚可通過(guò)調(diào)控其DNA損傷修復(fù)和Redox雙功能增加肺癌細(xì)胞放射治療敏感性。
　　5.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒能顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞PDT敏感性,主要是通過(guò)2種機(jī)制實(shí)現(xiàn)的:一方面通過(guò)抑制A549細(xì)胞PDT后的DNA損傷修復(fù)能力;另一方面通