人SHOX基因在小鼠胚胎肢芽軟骨形成中的功能.pdf

1、目的：
　　通過構(gòu)建人類矮小同源盒基因（hSHOX）的慢病毒，轉(zhuǎn)染Micromass培養(yǎng)的小鼠胚胎肢芽間充質(zhì)細(xì)胞，觀察軟骨小結(jié)形成，并以Real time PCR檢測軟骨發(fā)育相關(guān)基因的表達，探討hSHOX基因在軟骨發(fā)育過程中的功能。
　　方法：
　　1.構(gòu)建hSHOX基因慢病毒載體
　　將 hSHOX基因片段從pcDNA3.0載體上卸下，定向克隆連接入中間過渡載體pBS185，酶切獲得含有啟動子和多聚腺苷酸（Po

2、lyA）尾的目的基因片段，平端連接入慢病毒載體pNL-EGFP，獲得hSHOX基因慢病毒載體，命名為pNL-EGFP-hSHOX。
　　2. pNL-EGFP-hSHOX和pNL-EGFP-mShox2慢病毒載體目的基因檢測
　　將 pNL-EGFP-hSHOX、pNL-EGFP-mShox2以及空載體 pNL-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察EGFP，Westernblot檢測hSHOX基因和mShox2的表達。<

3、br>　　3.慢病毒生產(chǎn)
　　將pNL-EGFP-hSHOX、pNL-EGFP-mShox2以及空載體pNL-EGFP與輔助質(zhì)粒Helper、VSVG以一定比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集48h、72h病毒上清，經(jīng)超濾濃縮后，測定病毒滴度，獲得高滴度慢病毒顆粒。
　　4. Micromass培養(yǎng)小鼠E11.5肢芽間充質(zhì)細(xì)胞
　　野生型C57/BL小鼠交配及C57/BL-mSho x2+/-雌鼠和雄鼠交配，取E11.5肢芽，

4、分離間充質(zhì)細(xì)胞進行Micromass培養(yǎng)，同時感染慢病毒，介導(dǎo)mShox2基因和hSHOX基因表達，10ul含105細(xì)胞種植在培養(yǎng)孔中央，培養(yǎng)5天后部分培養(yǎng)物經(jīng)由Alcian Blue染色，觀察軟骨小結(jié)形成，其余培養(yǎng)物用于制備RNA并逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA備用。
　　5. Real time PCR檢測軟骨發(fā)育相關(guān)基因
　　根據(jù)GeneBnk上軟骨發(fā)育相關(guān)基因序列，設(shè)計特異性引物，以M icromass培養(yǎng)物cDNA為模板，進行

5、Real-time PCR分析，檢測軟骨發(fā)育相關(guān)基因的表達,如Runx2、ColX、Col2a、Osteocalin、Ihh、Sox9基因等。
　　結(jié)果：
　　1.通過酶切、測序和Western blot鑒定，成功構(gòu)建pNL-EGFP-hSHOX慢病毒載體；
　　2.獲得高滴度hSHOX和mShox2慢病毒；
　　3. E11.5肢芽間充質(zhì)細(xì)胞Micromass培養(yǎng)，mShox2基因敲除組軟骨小結(jié)數(shù)較野生型組減少

6、69％，具有顯著差異（p<0.01）；
　　4.野生型E11.5肢芽間充質(zhì)細(xì)胞Micromass培養(yǎng)，hSHOX基因和mShox2基因過表達軟骨小結(jié)數(shù)分別增加1.5和1.8倍，具有顯著差異（p<0.01）；
　　5. mShox2基因敲除小鼠E11.5肢芽間充質(zhì)細(xì)胞Micromass培養(yǎng)，hSHOX基因和mShox2基因過表達能挽救軟骨小結(jié)形成，數(shù)量分別增加3.5倍和3.9倍，具有顯著差異（p<0.01）；
　　6.

7、hSHOX和mShox2基因能夠上調(diào)Runx2和ColX基因表達。Runx2相對表達量為12.1，ColX基因相對表達量為2，P<0.01，差異顯著。
　　結(jié)論：
　　1. mShox2基因敲除小鼠肢芽軟骨小結(jié)形成數(shù)減少，hSHOX基因能夠挽救mShox2基因缺陷小鼠肢芽軟骨小結(jié)形成;
　　2.在軟骨小結(jié)形成過程中，hSHOX基因可上調(diào)Runx2ColX表達，表明hSHOX參與軟骨細(xì)胞分化肥大的過程;
　　3.在