TiO2納米管抗菌與生物活性雙功能種植體涂層的構(gòu)建與評(píng)價(jià).pdf

1、【背景】
　　牙科種植技術(shù)已成為牙列缺損或缺失的重要修復(fù)方法之一，但牙種植體相關(guān)感染仍是嚴(yán)重威脅，帶來一系列并發(fā)癥。種植體相關(guān)感染高發(fā)的原因主要有兩點(diǎn)：一是菌斑容易在種植體表面聚集且一旦形成很難去除；二是由于種植體的生物活性尚不理想，在種植體骨結(jié)合界面存在乏血管的纖維層使局部宿主抵抗力低下。因此，針對(duì)這兩點(diǎn)在種植體表面制備同時(shí)具有抗菌和高生物活性雙功能的涂層對(duì)于預(yù)防種植體相關(guān)感染，延長其使用壽命具重要意義。
　　人體自然組織

2、是由納米模塊組裝起來的，因此從仿生學(xué)的角度來看納米結(jié)構(gòu)應(yīng)該具有更好的生物活性。二氧化鈦（TiO2）納米管（NT）制備工藝簡(jiǎn)單而且它用電化學(xué)處理制備，適合應(yīng)用于形狀復(fù)雜的種植體表面。TiO2-NT的管徑可在幾十到幾百納米范圍內(nèi)變化，有利于篩選適合不同組織結(jié)合的納米尺寸。此外，TiO2-NT結(jié)構(gòu)能夠模擬骨組織中膠原原纖維的尺寸和排列，并且具有和骨組織相近的彈性模量。因此，通過優(yōu)化TiO2-NT結(jié)構(gòu)有希望獲得理想的生物活性。
　　阻止種

3、植體表面生物膜形成最有效的辦法是預(yù)防細(xì)菌的早期粘附，因?yàn)樯锬ひ坏┬纬珊茈y去除。從這個(gè)角度出發(fā)，抗菌涂層特別是載抗菌劑的涂層是一個(gè)有效途徑。TiO2-NT很好的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可作為藥物的載體，因此通過載入合適的抗菌劑可獲得抗菌能力。多種不同的抗生素都被嘗試用于抗菌涂層的制備，但抗生素的使用所帶來的產(chǎn)生耐藥菌株的風(fēng)險(xiǎn)嚴(yán)重限制了它們的應(yīng)用。經(jīng)過文獻(xiàn)回顧我們認(rèn)為銀是制備抗菌涂層的較為理想的選擇。銀具有多方面的優(yōu)點(diǎn)如廣譜抗菌能力甚至包括某些抗生素

4、耐藥菌、在合適的濃度時(shí)很好的生物相容性、良好的穩(wěn)定性以及產(chǎn)生耐藥菌的風(fēng)險(xiǎn)小等。此外，由于銀抗菌的有效濃度很低，可以通過在TiO2-NT中載入足夠多的銀和控制釋放速度獲得長期抗菌能力。
　　【目的】
　　探明影響TiO2-NT生物活性的因素，基于TiO2-NT篩選和研發(fā)具有更好生物活性的結(jié)構(gòu)；探索納米結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的機(jī)制，為進(jìn)一步指導(dǎo)種植體表面設(shè)計(jì)提供理論基礎(chǔ)；摸索合適的方法將銀載入TiO2-NT中以獲得長期抗菌能力；鑒于干

5、細(xì)胞在骨結(jié)合中的更重要的作用，研究TiO2-NT與干細(xì)胞的相互作用，為更合理的種植體表面設(shè)計(jì)提供依據(jù)；體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證這些結(jié)構(gòu)的效果。
　　【方法】
　　1）用陽極氧化方法在0.5wt％氫氟酸（HF）溶液中制備TiO2-NT，場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（FE-SEM）觀察制備的TiO2-NT的管徑大小、管的完整性和膜的均勻程度等。觀察陽極氧化電壓和時(shí)間對(duì)形成的TiO2-NT的影響；2）采用大鼠原代成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法評(píng)價(jià)5VTiO2-NT

6、（5VNT）和20VNT的生物活性。檢測(cè)不同電壓所形成的TiO2-NT的表面能差異，用DAPI染細(xì)胞核然后計(jì)數(shù)細(xì)胞粘附，MTT法測(cè)細(xì)胞活性，免疫熒光染色和SEM觀察細(xì)胞形態(tài)，試劑盒檢測(cè)細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）活性，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)；3）評(píng)價(jià)5VNT和20VNT經(jīng)高溫高壓、紫外照射和酒精浸泡消毒后生物活性的差異。測(cè)量不同方法消毒后試樣表面能的差異，試劑盒檢測(cè)其蛋白吸附能力以及細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性，用前面述及的方法檢測(cè)

7、細(xì)胞粘附、活性、胞內(nèi)ALP活性和總蛋白含量以及成骨相關(guān)基因的表達(dá)，天狼星紅染色法檢測(cè)細(xì)胞膠原分泌，茜素紅染色法檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）礦化；4）采用酸蝕加陽極氧化處理的方法制備微米坑/納米管梯度形貌，并用體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)的方法評(píng)價(jià)該仿生梯度形貌的生物活性；5）以成分為碳化鈦/碳?xì)ず私Y(jié)構(gòu)（TiC/C）或表面成分為TiO2的準(zhǔn)平行豎直排列的納米線陣列(QANWAs)為模型，用體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)的方法探索納米結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的機(jī)制；6）硝酸銀浸

8、泡加光照還原的方法將銀納米顆粒載入TiO2-NT中，控制硝酸銀的濃度和浸泡時(shí)間載入不同量的銀，體外評(píng)價(jià)其長期抗菌能力和生物相容性；7）體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），觀察TiO2-NT以及微米/納米梯度結(jié)構(gòu)在無成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（OS）的情況下對(duì)MSCs成骨分化的影響。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，觀察細(xì)胞內(nèi)ALP活性和總蛋白含量、膠原分泌和ECM礦化和基因表達(dá)水平。阻斷ERK1/2、JNK和PI3K/Akt信號(hào)

9、通路后觀察膠原分泌和ECM礦化；8）觀察OS對(duì)鈦和細(xì)胞培養(yǎng)板（TCP）表面培養(yǎng)的MSCs成骨分化的影響；9）體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證試樣的體內(nèi)效果。
　　【結(jié)果】
　　1）成功制備均勻分布的TiO2-NT結(jié)構(gòu)，管徑與陽極氧化電壓正相關(guān)，在3-20V的電壓下進(jìn)行陽極氧化分別形成管徑20-100nm的TiO2-NT陣列；2）在TiO2-NT表面早期細(xì)胞粘附未受明顯影響，與拋光鈦相比TiO2-NT提高成骨細(xì)胞ALP活性并誘導(dǎo)更多的ECM沉積。

10、細(xì)胞緊密地粘附到拋光鈦表面并且互相接觸，幾乎完全覆蓋整個(gè)表面，在5VNT表面細(xì)胞伸出結(jié)實(shí)的板狀偽足，而在20VNT表面細(xì)胞伸出大量纖細(xì)的絲狀偽足。細(xì)胞生長略受抑制，但細(xì)胞成骨相關(guān)功能基因的表達(dá)受到明顯抑制特別是在20VNT表面；3）與高溫高壓消毒相比，紫外照射和酒精浸泡消毒試樣的表面自由能較高，細(xì)胞粘附和增殖較好。其中紫外照射消毒表面的細(xì)胞功能最好，包括細(xì)胞粘附、增殖以及以ECM沉積及礦化和成骨相關(guān)功能基因的表達(dá)為標(biāo)志的細(xì)胞分化。不同消

11、毒方法的使用影響對(duì)納米形貌和拋光對(duì)照之間的生物活性的對(duì)比。如高溫高壓消毒后TiO2-NT表面的細(xì)胞早期粘附數(shù)量較多，但當(dāng)用紫外照射或酒精浸泡消毒時(shí)這一差異消失。當(dāng)采用酒精浸泡消毒時(shí)20VNT表面的細(xì)胞增殖比其它兩個(gè)試樣好，但當(dāng)采用紫外照射或高溫高壓消毒時(shí)三個(gè)試樣表面的細(xì)胞增殖無差異；4）成功制備微米坑/納米管梯度仿生形貌。發(fā)現(xiàn)酸蝕微米形貌對(duì)成骨細(xì)胞功能的促進(jìn)作用不均衡，雖然細(xì)胞早期粘附和成骨相關(guān)功能基因的表達(dá)得到促進(jìn)，但細(xì)胞其它功能被抑

12、制。在微米形貌上加入納米管之后同時(shí)促進(jìn)或保持成骨細(xì)胞的多個(gè)功能；5）成功制備TiC/C和TiO2兩種不同表面成分的QANWAs，TiC/CQANWAs為超疏水性而TiO2QANWAs與光滑對(duì)照相比更加親水。QANWAs阻礙細(xì)胞粘附導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其它的細(xì)胞功能如增殖和分化也明顯受到抑制。QANWAs的細(xì)胞排斥特性主要來源于它們的特殊結(jié)構(gòu)，不受表面化學(xué)成分和表面潤濕性的影響，也并非源于蛋白吸附量的降低；6）通過硝酸銀浸泡加光照還原的方法成功

13、制備載銀納米管（NT-Ag），銀納米粒子緊密地粘附到納米管的內(nèi)壁，并且銀納米粒子的大小可以通過控制硝酸銀的濃度和浸泡時(shí)間來調(diào)整。NT-Ag在第一周內(nèi)可有效殺滅種植體周圍浮游細(xì)菌，而其預(yù)防活細(xì)菌粘附的能力在觀察的兩周內(nèi)無明顯下降；7）首次系統(tǒng)地觀察了TiO2-NT、酸蝕形貌、微米/納米梯度形貌在不使用OS的條件下對(duì)MSCs成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)所有的這些形貌均可在無OS的情況下誘導(dǎo)MSCs成骨分化。其中，20VNT和Micro/20VNT誘

14、導(dǎo)MSCs成骨分化的能力最強(qiáng)；8）在TCP表面OS的使用略微抑制MSCs增殖但明顯促進(jìn)以膠原分泌和ECM礦化為代表的MSCs分化。而在鈦表面，OS仍就抑制MSCs增殖且該作用與TCP表面相比稍微明顯一些，但細(xì)胞分化并未像在TCP表面那樣受到促進(jìn)而是遭到顯著抑制，細(xì)胞內(nèi)ALP活性和總蛋白含量、膠原分泌和ECM礦化均降低。OS在鈦表面對(duì)干細(xì)胞分化的抑制作用與其表面形貌無關(guān)；9）體內(nèi)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明20VNT在早期可促進(jìn)種植體骨結(jié)合。
　

15、　【結(jié)論】
　　1）可以通過簡(jiǎn)單的陽極氧化方法在鈦表面制備不同管徑（20-100nm）的TiO2-NT，從而可以篩選適合不同組織結(jié)合的納米尺寸。
　　2）TiO2-NT尤其是較大管徑的納米管抑制原代成骨細(xì)胞的某些功能如成骨相關(guān)功能基因的表達(dá)，原因在于TiO2-NT阻礙其表面細(xì)胞粘著斑的組裝。原代成骨細(xì)胞與細(xì)胞系表型的不一致使它們對(duì)TiO2-NT的反應(yīng)不同，可能是目前關(guān)于TiO2-NT生物活性存在爭(zhēng)議的原因。
　　3）消

16、毒方法明顯影響TiO2-NT的表面特性從而影響其表面成骨細(xì)胞功能。各試驗(yàn)中使用的不同消毒方法影響對(duì)納米形貌和拋光對(duì)照之間的生物活性的對(duì)比，提示消毒方法的不一致是目前關(guān)于TiO2-NT生物活性的報(bào)道出現(xiàn)爭(zhēng)議的一個(gè)重要原因。其中紫外照射消毒表面的細(xì)胞功能最好，原因在于紫外照射消毒能有效去除試樣表面的碳?xì)湮廴尽?br>　　4）酸蝕微米形貌對(duì)成骨細(xì)胞功能的促進(jìn)作用不均衡，在微米形貌上加入納米管之后更平衡地促進(jìn)或保持成骨細(xì)胞的多個(gè)功能。該結(jié)果首次

17、揭示了微米和納米形貌對(duì)細(xì)胞功能的協(xié)同作用，提示微米/納米梯度結(jié)構(gòu)可能從生物學(xué)的角度來講更合理，這對(duì)種植體表面設(shè)計(jì)具有很大指導(dǎo)意義。
　　5）QANWAs阻礙細(xì)胞粘附導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，原因可能在于對(duì)細(xì)胞粘著斑組裝的阻礙。該結(jié)果提示納米形貌包括TiO2-NT調(diào)控細(xì)胞功能的一個(gè)重要機(jī)制就是調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，包括整合素的簇集和粘著斑的組裝和成熟。
　　6）通過簡(jiǎn)單的硝酸銀浸泡加光照還原的方法可以制備NT-Ag。載有適量銀的NT-Ag在早期一

18、周內(nèi)可有效殺滅種植體周圍浮游細(xì)菌，而其預(yù)防活細(xì)菌粘附的能力在觀察的兩周內(nèi)無明顯下降，提示NT-Ag的長效抗菌能力。雖然NT-Ag表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，但在接下來的試驗(yàn)中我們可以通過縮小管口等方法控制銀的釋放速率以消除細(xì)胞毒性。
　　7）20VNT和微米/20VNT梯度形貌誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的能力最強(qiáng)。形貌因素的骨誘導(dǎo)能力源于它們對(duì)細(xì)胞粘著斑以及接下來的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。ERK1/2、JNK和PI3K/Akt均參加了微米/納米形貌表面