胸腺素α1-胸腺五肽融合肽的制備、體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)與輔助抗腫瘤作用及與TLR2結(jié)合性質(zhì)研究.pdf

1、惡性腫瘤致死率高，是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。目前，臨床上主要采用的非手術(shù)治療手段有化學(xué)治療、放射治療等，但這些手段在治療腫瘤的同時(shí)也使患者的免疫功能受到嚴(yán)重破壞。因此，尋找能夠在腫瘤治療中提高機(jī)體免疫功能的免疫調(diào)節(jié)劑具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。胸腺五肽(Thymopentin，TP5)和胸腺素α1(Thymosin，Tα1)是從胸腺中獲得的兩種多肽，二者具有相似的免疫調(diào)節(jié)活性，是重要的免疫調(diào)節(jié)劑，已成功用于臨床腫

2、瘤輔助治療，能提高化療或放療病人的免疫應(yīng)答及耐受性，抑制或降低病情的進(jìn)展或復(fù)發(fā)，延長(zhǎng)病人的生存期，提高病人的生活質(zhì)量。但是，TP5的體內(nèi)半衰期(t1/2)很短，人體內(nèi)藥代學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TP5的t1/2只有30s。需要頻繁的給藥才能維持療效。Tα1的體內(nèi)t1/2較長(zhǎng)（約為100min），但目前主要以化學(xué)合成的方法生產(chǎn)，價(jià)格昂貴，難以被廣大患者所接受。
　　 為了提高TP5的活性，延長(zhǎng)其體內(nèi)t1/2，本課題組已將具有相似生物活性與臨床用

3、途的TP5和Tα1借助基因工程方法連接在了一起，在畢赤酵母Pichiapastoris中表達(dá)制備了融合肽Tα1-TP5。研究證實(shí)Tα1-TP5具有比TP5更強(qiáng)的體外刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及體內(nèi)促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬的能力，Tα1-TP5也具有比TP5及Tα1更長(zhǎng)的體外血漿t1/2。但是，Tα1-TP5經(jīng)Pichiapastoris分泌表達(dá)的量很少，無法滿足進(jìn)一步體內(nèi)試驗(yàn)研究的需求，并且需要凝血酶切割去掉融合標(biāo)簽，純化成本高，純化步驟繁瑣。切割

4、后，Tα1-TP5的N端帶有2個(gè)多余的氨基酸殘基，C端帶有多余的4個(gè)氨基酸殘基，可能存在免疫原性。
　　 故為了提高產(chǎn)量并降低純化成本，本課題換用大腸桿菌表達(dá)體系，采用內(nèi)含肽介導(dǎo)的純化系統(tǒng)，加入二硫蘇糖醇(DTT)誘導(dǎo)內(nèi)含肽自切割，分別從細(xì)菌裂解上清及包涵體中純化Tα1-TP5?？疾霻α1-TP5是否具有比TP5及Tα1更強(qiáng)的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性及輔助抗腫瘤作用，并進(jìn)一步采用表面等離子共振技術(shù)(SPR)研究Tα1-TP5與Toll樣

5、受體2(TLR2)的結(jié)合情況，為將Tα1-TP5開發(fā)成一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑提供重要的基礎(chǔ)與依據(jù)。
　　 本課題的研究?jī)?nèi)容及取得的主要成果有以下幾個(gè)方面。
　　 1、Tα1-TP5在大腸桿菌中的表達(dá)及純化
　　 采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Tα1-TP5進(jìn)行了融合表達(dá)。選用pTYB2作為表達(dá)載體，將Tα1-TP5基因插入至內(nèi)含肽(Sceintein)基因的N端，Sceintein基因的C端與幾丁質(zhì)結(jié)合域(Chitinbi

6、ndingdomain，CBD)相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTYB2-Tα1-TP5-Sceintein-CBD，轉(zhuǎn)入E.coliER2566中誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。超聲裂解菌體后SDS-PAGE考察重組蛋白的可溶表達(dá)情況。考察不同誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)濃度對(duì)重組蛋白可溶表達(dá)量的影響。采用親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，加入DTT誘導(dǎo)intein柱上自切割，從而釋放Tα1-TP5。為了提高Tα1-TP5的產(chǎn)量，也從包涵

7、體中純化了Tα1-TP5。摸索了包涵體的洗滌條件，采用直接稀釋法對(duì)包涵體蛋白Tα1-TP5-Sceintein-CBD進(jìn)行復(fù)性，并考察還原劑和氧化劑的比例、L-精氨酸(L-Arg)及最終尿素的濃度對(duì)復(fù)性效率的影響。復(fù)性后的蛋白過親和層析柱，加入DTT誘導(dǎo)intein柱上自切割，從而獲得Tα1-TP5。Tα1-TP5進(jìn)一步經(jīng)Superdex30純化并脫鹽后，ESI-MS鑒定其分子量的正確性。Tricine-SDS-PAGE鑒定Tα1-TP

8、5的純度。
　　 結(jié)果顯示，Tα1-TP5成功在E.coliER2566中表達(dá)，融合蛋白部分以包涵體的形式存在，誘導(dǎo)溫度由37℃降低至16℃時(shí)可使可溶蛋白的表達(dá)量由原來的15.9％增加至18.9％，而IPTG濃度由1mmol/L降至0.1mmol/L對(duì)可溶蛋白表達(dá)量影響不大。復(fù)性體系中還原劑和氧化劑的比例為1∶22.5、尿素終濃度為0.8mol/L時(shí)復(fù)性效率最高。L-Arg的加入對(duì)復(fù)性效率影響不大。Superdex30進(jìn)一步純化

9、和脫鹽后，從菌體裂解上清中獲得了約4.6mgTα1-TP5，從包涵體中獲得了約3.0mgTα1-TP5。ESI-MS分別鑒定分子量，發(fā)現(xiàn)與理論值相當(dāng)(3785.02Da)，Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)Tα1-TP5的純度大于95％。最終我們運(yùn)用此方法從每L發(fā)酵液中得到了約7.6mgTα1-TP5。
　　 2、Tα1-TP5體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)活性研究
　　 采用CCK-8法測(cè)定了Tα1-TP5對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)

10、作用，采用流式細(xì)胞術(shù)考察了Tα1-TP5對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞表面CD69分子表達(dá)的促進(jìn)作用，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Tα1-TP5對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ表達(dá)的的影響。結(jié)果表明:從上清及包涵體中純化的Tα1-TP5均能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，且作用呈濃度依賴性，濃度為40μg/mL時(shí)，增殖率分別為26.21％、21.84％，與陰性組比較差異具有顯著性意義(p＜0.01，p＜0.01)。Tα1-TP5能促進(jìn)CD69的表達(dá)，與陰性對(duì)照組比較

11、差異具有顯著性意義(21.51％vs.9.5％，p＜0.05)，Tα1-TP5促進(jìn)淋巴細(xì)胞表面CD69表達(dá)的能力也較TP5(16.06％)和Tα1(16.65％)高。RT-PCR結(jié)果顯示Tα1-TP5能在基因水平上促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)，且促進(jìn)IFN-γ表達(dá)的能力高于TP5及Tα1。說明我們純化的Tα1-TP5具有比TP5及Tα1更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。
　　 連續(xù)2天腹腔注射劑量為250mg/kg氫化可的松(HC)，建立小鼠體內(nèi)免疫

12、抑制模型，皮下注射Tα1-TP5連續(xù)治療2周，考察Tα1-TP5對(duì)小鼠免疫抑制的抵抗作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tα1-TP5能明顯增強(qiáng)免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)，與模型組比較差異具有顯著性意義（2.253±0.427vs.0.444±0.407，p＜0.05），與TP5及Tα1單獨(dú)給藥組比較差異也具有顯著性意義(p＜0.05)。但Tα1-TP5對(duì)脾臟指數(shù)的影響不大。HE染色分析Tα1-TP5能改善HC導(dǎo)致的胸腺萎縮，增加胸腺組織中胸腺細(xì)胞的數(shù)量。另外

13、Tα1-TP5能使CD4+CD8+胸腺細(xì)胞的比例恢復(fù)至正常水平。與模型組比較，Tα1-TP5顯著增加外周血中IFN-γ的含量，抵抗HC造成的IFN-γ水平降低。總之，Tα1-TP5具有改善HC誘導(dǎo)的免疫抑制狀態(tài)的能力，且活性比TP5及Tα1更強(qiáng)。
　　 3、Tα1-TP5輔助抗腫瘤作用研究
　　 采用CCK-8法測(cè)定了Tα1-TP5對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、肝癌細(xì)胞HepG2、肺癌細(xì)胞A549及黑色素瘤細(xì)胞B16

14、四種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果表明:Tα1-TP5對(duì)四種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用呈時(shí)間依賴性，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，72h時(shí)細(xì)胞活力只占陰性組的64.6％，顯著高于TP5組(64.6％vs.90.8％，p＜0.05)，但是與Tα1組比較沒有顯著性差異（64.6％vs.70.2％，p＞0.05）。Tα1-TP5對(duì)HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞的抑制作用稍弱于對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞，72h時(shí)細(xì)胞活力分別占陰性組的73.

15、9％及69.9％，抑制作用強(qiáng)于TP5但與Tα1差別不大。Tα1-TP5對(duì)B16細(xì)胞也有一定的抑制作用，72h時(shí)細(xì)胞活力只占陰性組的82.5％，抑制作用與TP5及Tα1相比沒有顯著性差異。
　　 建立C57BL/6小鼠荷黑色素瘤模型，考察Tα1-TP5聯(lián)合環(huán)磷酰胺(CY)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果表明:與CY單獨(dú)給藥相比，Tα1-TP5聯(lián)合CY明顯降低腫瘤體積及腫瘤重量，藥物治療2周后腫瘤重量減少了將近88.1％。Tα1-TP5也

16、能逆轉(zhuǎn)CY導(dǎo)致的外周血中白細(xì)胞數(shù)量減少，治療2周后外周血中白細(xì)胞數(shù)量增加至正常水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CY組MHCⅠ的表達(dá)率只有11.65％，而Tα1-TP5能顯著增加腫瘤組織中MHCⅠ的表達(dá)，與CY組比較差異具有顯著性(28.71％vs.11.65％，p＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示Tα1-TP5較TP5及Tα1更能促進(jìn)腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)及CD86的表達(dá)?？梢奣α1-TP5具

17、有弱的直接殺傷B16細(xì)胞的功能，主要通過激活免疫系統(tǒng)而發(fā)揮輔助抗腫瘤作用。
　　 4、Tα1-TP5與TLR2結(jié)合活性研究
　　 采用激光共聚焦顯微鏡觀察考察Tα1-TP5與骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDMs)的結(jié)合情況。將Tα1-TP5、TP5及Tα1分別用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記，并分別與分離的BMDMs孵育2h，再用Hoechst33342及DiI分別標(biāo)記細(xì)胞核及細(xì)胞膜，激光共聚焦顯微鏡觀察藥物結(jié)合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

18、，Tα1-TP5、TP5及Tα1均能結(jié)合在BMDMs的細(xì)胞膜上。
　　 采用SPR技術(shù)檢測(cè)Tα1-TP5與存在于BMDMs上的TLR2的結(jié)合。將TLR2作為配體以氨基偶聯(lián)的方式偶聯(lián)到CM5芯片上，Tα1-TP5、TP5及Tα1作為待分析物流過芯片表面，考察三種多肽與TLR2的結(jié)合能力及親和力大小。結(jié)果顯示:SPR技術(shù)能夠準(zhǔn)確反映三種多肽與TLR2的結(jié)合水平。Tα1-TP5、TP5及Tα1與TLR2的解離平衡常數(shù)（KD）分別為6.

19、84×10-6mol/L、1.57×10-6mol/L及35.4×10-6mol/L。Tα1-TP5與TLR2的結(jié)合能力顯著強(qiáng)于Tα1，但與TP5相比沒有顯著性差異。到目前為止，三種多肽可能的受體首次被確定。
　　 本研究取得的主要成果和結(jié)論如下:
　　 (1)首次構(gòu)建了表達(dá)Tα1-TP5的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)重組蛋白質(zhì)成功進(jìn)行了表達(dá)，并利用內(nèi)含肽介導(dǎo)的純化系統(tǒng)分別從細(xì)菌裂解上清及包涵體中分離純化了Tα1-TP5，Sup

20、erdex30進(jìn)一步純化得到了高純度的目的多肽。獲得的Tα1-TP5C端只含有一個(gè)多余的甘氨酸(Gly)殘基。此研究提供了一種高效率、低成本的純化策略，適合Tα1-TP5的大規(guī)模生產(chǎn)。
　　 (2)純化的Tα1-TP5能明顯促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖、CD69及IFN-γ的表達(dá)，展示了較好的體外免疫調(diào)節(jié)活性。
　　 (3)首次進(jìn)行了Tα1-TP5的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性研究。Tα1-TP5能抵抗HC誘導(dǎo)的免疫抑制，且效果較TP5