白紋伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白(alALP)的重組表達(dá)和功能研究.pdf

1、蚊能傳播多種疾病，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。蚊唾液腺中存在多種功能蛋白，如抗凝劑、抗炎劑和免疫流行病學(xué)分子靶標(biāo)等。雖然，已有報(bào)道蚊唾液腺30KD的蛋白組分是主要的分泌蛋白，具有很強(qiáng)的抗原性，但是其單個(gè)成員的蛋白抗原性及是否具有其它生物學(xué)活性尚不清楚。最近報(bào)道了其成員之一的埃及伊蚊(Aedesaegypti)aegyptin蛋白具有抗凝血活性，能特異性阻斷血小板和膠原蛋白的結(jié)合。本文通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，白紋伊蚊（aedes albopictu

2、s）30KD蛋白家族的一個(gè)成員與aegyptin蛋白高度同源，命名為白紋伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白（A.albopictus aegyptin-like protein，alALP），并構(gòu)建表達(dá)載體，制備了重組alALP，初步分析了其抗原性及抗凝血活性。
　　目的：
　　構(gòu)建alALP的原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)，制備重組alALP融合蛋白，分析其抗原性和抗凝血活性，探討alALP作為暴露蚊叮咬免疫流行病學(xué)分子靶標(biāo)和

3、抗凝血活性藥物的可行性。
　　方法：
　　1.生物信息學(xué)分析。運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析蚊唾液腺30KD蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析alALP與aegyptin蛋白的同源性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性和抗原肽段，分析alALP蛋白的信號(hào)肽和成熟肽。
　　2.alALP基因的克隆。提取白紋伊蚊唾液腺總RNA，根據(jù)alALP的基因編碼序列(Genbank: AAV90693.1)設(shè)計(jì)引物，RT-PCR擴(kuò)增alALP的成熟肽基因，亞克隆至p

4、MD19-T載體，測(cè)序驗(yàn)證。
　　3.alALP的原核表達(dá)和抗原性分析。擴(kuò)增alALP的成熟肽基因，克隆到E.ColiBL21原核表達(dá)載體(pGEX-6P-1)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析重組融合蛋白GST-alALP的表達(dá)情況。利用谷胱甘肽瓊脂糖4B和超濾器純化濃縮GST-alALP，皮下注射免疫ICR小鼠3次，每次免疫劑量60μg，

5、制備小鼠抗GST-alALP血清。分別以小鼠抗GST-alALP血清和白紋伊蚊叮咬后小鼠血清為一抗，Westernblotting分析GST-alALP的抗原性。
　　4.alALP的真核表達(dá)和抗凝血活性分析。根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好，優(yōu)化合成alALP的成熟肽基因，克隆到畢赤酵母X33真核表達(dá)載體(pPICZαA)中進(jìn)行表達(dá)。利用SDS-PAGE和Western blotting分析重組融合蛋白ralALP的表達(dá)情況。ralALP

6、經(jīng)鎳螯合親和層析柱純化、透析袋換液和超濾器濃縮，手動(dòng)法檢測(cè)其對(duì)凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的影響，以分析alALP的抗凝血活性。
　　結(jié)果：
　　本文構(gòu)建了蚊唾液腺30KD蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);比對(duì)分析了alALP與aegyptin等蛋白的同源性;成功構(gòu)建了alALP的原核和真核表達(dá)系統(tǒng);初步分析了alALP的抗原性和抗凝血活性，得出了如下主要結(jié)果和結(jié)論:
　　(1)蚊唾液

7、腺30KD蛋白家族在進(jìn)化上保守，而alALP較AAPP和GE rich蛋白與aegyptin更接近;alALP與aegyptin的蛋白序列具有65.58％的一致性，它們的羧基端十分保守，它們具有相同的信號(hào)肽、相似的親水性和一段保守的抗原肽段;alALP、aegyptin、AAPP和GE_rich蛋白的羧基端保守，它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有相同的折疊域。這些結(jié)果預(yù)示，alALP可能具有aegyptin相似的生物學(xué)活性。
　　(2)成功擴(kuò)增到

8、目的alALP基因并將其克隆到了pMD19-T載體中，經(jīng)測(cè)序證實(shí)該DNA片段就是目的alALP基因。
　　(3)成功構(gòu)建了高表達(dá)的alALP原核表達(dá)系統(tǒng)。在37℃、1mmol/LIPTG誘導(dǎo)6～8 h，重組融合蛋白GST-alALP表達(dá)量高且無(wú)降解，主要以可溶性蛋白形式表達(dá)。GST-alALP具有很強(qiáng)的抗原性，免疫小鼠能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，且能被白紋伊蚊叮咬后的小鼠血清識(shí)別。這些結(jié)果說(shuō)明，alALP具有進(jìn)一步作為暴露蚊叮咬的免疫流

9、行病學(xué)分子標(biāo)志物的研究意義。
　　(4)成功構(gòu)建了高表達(dá)的alALP真核表達(dá)系統(tǒng)。在30℃、1％甲醇誘導(dǎo)48 h，重組蛋白ralALP表達(dá)量高且無(wú)降解，可以被正常分泌到細(xì)胞外。ralALP具有抗凝血活性，能顯著延長(zhǎng)凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)。alALP的抗凝血機(jī)制是否和aegyptin一樣特異性阻斷血小板和膠原蛋白的結(jié)合，還無(wú)法確定。這些結(jié)果表明，alALP具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗凝血活性