含銀敷料表征和銀的釋放及納米銀毒理學(xué)研究.pdf

1、納米銀(AgNPs)以其優(yōu)異的廣譜抗菌性能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、紡織、食品包裝、化妝品、水質(zhì)凈化等領(lǐng)域。然而隨著AgNPs產(chǎn)品大量的生產(chǎn)和使用，人體和環(huán)境暴露機(jī)會也逐漸增加，引起人們對其安全問題的關(guān)注。特別是含銀敷料類產(chǎn)品在與患者接觸的過程中，伴隨著AgNPs及銀離子（Ag+）的脫落和釋放;且AgNPs本身作為釋放源，會持續(xù)釋放Ag+，對人體造成潛在的毒性風(fēng)險。另一方面，AgNPs毒性也與人體暴露時間及AgNPs或Ag+的濃度有關(guān)。因此，

2、含銀敷料中銀存在形式的表征和銀釋放與脫落的研究是評價其潛在風(fēng)險的基礎(chǔ)和關(guān)鍵步驟;并且有關(guān)AgNPs對小鼠成纖維細(xì)胞(L929)毒性機(jī)制仍不清楚。
　　本文以三種含銀敷料（Anson、YB、AT敷料）作為研究對象，采用掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)觀察敷料表面形貌及表面顆粒粒徑分布，并采用X射線能量色散譜儀(EDS)分析表面元素分布;采用X射線光電子能譜(XPS)和X射線衍射(XRD)分析銀顆粒的價態(tài)及晶體結(jié)構(gòu)。

3、表征結(jié)果顯示Anson、YB和AT敷料表面均含有單質(zhì)銀(Ag0)。Anson敷料表面銀顆粒粒徑為5～25 nm，且存在化合態(tài)銀（Ag+），其表面銀顆粒為無定型銀;YB敷料表面銀顆粒粒徑為5～10 nm，團(tuán)聚銀顆粒粒徑為30～40 nm，其表面銀顆粒為無定型銀;AT敷料表面銀顆粒粒徑為30～45 nm，表面銀顆粒為立方相銀，根據(jù)Scherrer公式計算其表面銀顆粒平均晶粒尺寸為30nm。
　　采用往復(fù)支架法研究敷料在水(H2O)和模

4、擬體液(SBF)中銀的釋放，并通過原子吸收法（AAS）測量釋放的銀含量。由于SBF中氯離子(Cl-)與敷料中釋放的Ag+結(jié)合生成氯化銀(AgCl)顆粒，其粒徑與AgNPs接近，難以區(qū)分。在高Cl-/Ag+濃度比的條件下，AgCl沉淀會形成可溶性的陰離子銀絡(luò)合物;因而首先研究在SBF中Ag+濃度對AgCl溶解性影響，解決AgCl顆粒干擾AgNPs分離的難題，最后通過超濾離心有效地區(qū)分AgNPs和Ag+;通過噻唑藍(lán)比色法(MTT)和乳酸脫氫

5、酶(LDH)法評價敷料浸提液對小鼠成纖維細(xì)胞(L929)毒性作用及與銀表征與釋放的相關(guān)性。AgCl溶解性結(jié)果顯示在SBF中，當(dāng)Ag+濃度低于0.5μg/mL時，AgCl的溶解性達(dá)到96.7％;進(jìn)一步降低Ag+濃度，AgCl溶解性并沒有顯著性增加，故確定Ag+濃度0.5μg/mL為AgCl溶解性的閾值;體外釋放實驗顯示Anson敷料在SBF中釋放總銀含量是在H2O中釋放量的2倍以上;對敷料釋放液總銀測量后，若總銀含量高于0.5μg/mL，

6、則通過SBF稀釋釋放液，使總銀含量低于0.5μg/mL;若低于0.5μg/mL，則直接通過10 kD濾膜離心后，分離AgNPs和Ag+。Anson、YB及AT敷料在SBF中總銀釋放量分別為12.40、49.23和59.90μg/cm2，AgNPs釋放量分別為2.54、17.86和29.04μg/cm2;細(xì)胞毒性結(jié)果顯示三種敷料浸提液均對L929細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，引起細(xì)胞內(nèi)LDH釋放，其中AT敷料細(xì)胞毒性最強(qiáng)，Anson敷料細(xì)胞毒性

7、最弱，與總銀及AgNPs釋放量的結(jié)果具有相似性。
　　AgNPs毒理學(xué)實驗中，采用TEM、動態(tài)光散射(DLS)、Zeta電位和紫外-可見吸收光譜(UV-vis)對AgNPs進(jìn)行理化表征;采用MTT和LDH法評價AgNPs對L929細(xì)胞毒性作用;通過測量細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)活力和丙二醇(MDA)含量，研究AgNPs毒性機(jī)制。由于N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以有效的清除細(xì)

8、胞內(nèi)過多ROS，研究同時加入AgNPs和NAC對細(xì)胞活性和氧化應(yīng)激影響。表征結(jié)果顯示AgNPs為球形顆粒，且分布均勻，粒徑在4～30 nm左右，其中5～10 nm占72％，平均粒徑為7.25 nm;100μg/mLAgNPs在H2O中Zeta電位為-37.83±3.20 mV，特征峰在415nm左右。AgNPs可引起L929細(xì)胞活性降低和LDH釋放量增加，且與濃度具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。在1.25μg/mL和1.50μg/mL濃度下，細(xì)胞活

9、性分別為60％和36％，LDH釋放率分別為28％和39％，細(xì)胞活性半抑制濃度(IC50)為1.38μg/mL; NAC處理細(xì)胞后，細(xì)胞活性上升與LDH釋放量降低，并與對照組無顯著性差異。進(jìn)一步研究證實不同濃度AgNPs可引起L929細(xì)胞內(nèi)水平ROS升高，SOD和GSH-px活力降低，MDA含量升高;當(dāng)AgNPs濃度為1.00μg/mL和1.25μg/mL時，細(xì)胞內(nèi)ROS含量為對照組1.8倍和2.4倍，SOD活力分別下降13.1％和24.

10、3％，GSH-px活力分別下降21.5％和35.0％，MDA含量分別升高74.0％和106.6％，與對照組有顯著性差異，且與AgNPs濃度具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，這些結(jié)果提示AgNPs引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激是AgNPs引起細(xì)胞毒性的主要機(jī)理。而AgNPs作用同時加入NAC抗氧化處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS、SOD、GSH-px和MDA恢復(fù)正常水平，與對照組無顯著性差異，進(jìn)一步證實ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是AgNPs引起細(xì)胞毒性的主要機(jī)制之一。
　　本