殼多糖和外源性堿性成纖維細胞生長因子聯(lián)合應用對創(chuàng)傷愈合影響的實驗研究.pdf

1、目的：聯(lián)合應用殼多糖(chitosan，CTS)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growt factor，bFGF)干預大鼠背部創(chuàng)傷模型，觀察其對鼠背部創(chuàng)面愈合的影響，并探討作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)。 方法 1 實驗動物：48只雄性健康Wistar大鼠，體重200g-250g，編號。 2 動物分組：將大鼠隨機分為四組，即對照組、CTS組、bFGF組、CTS+bFGF組，每組均

2、為12只。 3 創(chuàng)傷模型制備方法：腹腔注射10％水合氯醛(30mg/kg)麻醉，8％硫化鈉背部脫毛備皮，面積為4×5cm<'2>。次日，麻醉成功后，將大鼠固定于手術臺上。在背部脊柱兩側(cè)旁開0.9cm，頭尾兩端平行于脊柱各標記一直徑1.8cm，面積2.54cm<'2>的圓形切口線。經(jīng)消毒鋪巾后，用手術刀沿標記線切除全層皮膚至深筋膜，形成4個圓形創(chuàng)面。 4 給藥方法：對照組、CTS組、bFGF組、CTS+bFGF組分別用蒸餾

3、水、CTS、bFGF、CTS+bFGF藥液浸透雙層紗布覆蓋創(chuàng)面，再蓋以凡士林油砂，無菌紗布包扎，繃帶固定，每日換藥一次。 5 取材：每組動物分為4組，每組3只，分別于術后第3、7、10、14天切取原創(chuàng)傷范圍內(nèi)組織。所取組織中用4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，分別行常規(guī)HE染色、Massoll染色和免疫組化染色。 6 觀測指標 6．1創(chuàng)面大體觀察：每日換藥時肉眼觀察創(chuàng)面炎癥反應。 6．2創(chuàng)面愈合時間

4、：以創(chuàng)面面積小于總面積的5％或愈合面積大于95％為完全愈合。 6．3創(chuàng)面愈合率的觀察：各組動物分別在傷后第3、7、10、14天，用0.25×0.25的透明方格紙測定傷口面積，用德國產(chǎn)ASM-68K半自動圖像分析儀計算傷口面積。傷口愈合速率=愈合面積/原傷口面積×100％。 6．4光鏡組織學觀察：HE染色和Masson染色后，觀察術后第3、7、10、14天組織中新生毛細血管，膠原纖維以及細胞滲出的變化。 6．5膠原

5、纖維面密度(area density on area，AA)：Masson染色組織切片，在肉芽組織中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機選取5個視野，利用計算機輔助病理圖像分析系統(tǒng)計算綠染的膠原纖維的面密度，結(jié)果取均數(shù)。 6．6血管內(nèi)皮生長因子(Vasctllar Endothelial GrowthFactor,VEGF)免疫組化染色切片：光鏡觀察血管內(nèi)皮生長因子分布部位和表達。采用Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行

6、定量分析，每組選4張切片，每張切片選取有代表性區(qū)域，隨機取互不重疊的5個200倍視野，以光密度200為背底，彩色攝像機取圖，測量平均光密度和積分光密度值并用計算機進行統(tǒng)計學處理。 6．7-氧化氮合酶(nitric oxide syntlaase，NOS)免疫組化染色切片，光鏡觀察NOS分布部位和著色深淺程度。在200倍光鏡下隨機選5個視野，計算總細胞數(shù)和陽性細胞數(shù)，并計算陽性細胞率。 7 統(tǒng)計學處理：用SPSS13.

7、0統(tǒng)計處理軟件，對各種數(shù)據(jù)進行處理。 結(jié)果 1 創(chuàng)面大體觀察：傷后早期對照組創(chuàng)面腫脹、滲出及創(chuàng)周紅腫最為明顯，CTS組、bFGF組依次次之，CTS+bFGF組最輕，各組均未感染。 2 創(chuàng)面愈合時間的觀察：對照組為15.28±0.6419天、CTS組為14.02±0.4817天、bFGF組為12.50±0.6245、CTS+bFGF組為10.24±0.4827天，四組有非常顯著性差異(單向方差分析，F(xiàn)=74.23

8、，P(0.01)。CTS+bFGF組愈合天數(shù)明顯短于CTS組、bFGF組和對照組(P<0.01)。 3 創(chuàng)面愈合率的觀察：從附表2可見，CTS+bFGF組創(chuàng)面愈合率高于bFGF組、CTS組以及對照組，四組有顯著性差異(重復測量方差分析，F(xiàn)=410.36，P<0.05)，兩兩比較有非常顯著性差異(P<0.01)；愈合率隨時間推移明顯升高(F=637.86，P<0.01)，四個時間點兩兩比較有非常顯著性差異(P<0.01)。組別與時

9、間交互效應有顯著性差異(F=44.54，P<0.05)。 4 光鏡觀察：CTS+bFGF組、CTS組以及bFGF組在創(chuàng)傷后第3天比對照組有較多毛細血管生成，創(chuàng)傷后14天成纖維細胞排列整齊。 5 膠原纖維面密度(AA)：四組均成持續(xù)性增加趨勢，傷后四組有非常顯著性差異(F=937.46，P<0.01)，CTS+bFGF組明顯高于其它三組(P<0.01)，但對照組第與CTS組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；傷后3、7、10

10、、14天之間，兩兩比較均有非常顯著性差異(P(0.01)；組別與時間之間交互效應無統(tǒng)計學意義(F=2.49，P>0.05)。 6 VEGF免疫組化染色結(jié)果：四組大血管和新生毛細血管的內(nèi)皮細胞均有陽性表達。對照組第3天和第14天分別呈現(xiàn)VEGF陽性顆粒表達高峰。而CTS組VEGF表達則在第7天達到高峰，之后緩慢下降。CTS+bFGF組和bFGF組在傷后第10天達到最高，至傷后第14天仍保持較高水平。傷后四組兩兩比較有非常顯著性差

11、異(F=1217.35，P<0.01)，CTS+bFGF組明顯高于其它三組(P<0.01)；傷后3、7、10、14天之間，兩兩比較均有顯著性差異(P<0.05)；組別與時間之間交互效應有統(tǒng)計學意義(F=48.12，P<0.05)。 7 NOS在創(chuàng)面組織中的表達：皮膚中角質(zhì)形成細胞、汗腺和骨骼肌細胞以及創(chuàng)傷后肉芽組織的炎癥細胞、成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞均可表達NOS蛋白。傷后四組兩兩比較有非常顯著性差異(F=234.45，P<0